Sander Heeman, B.Sc., senior analist bij AQUON | Foto: AQUON
Kwantitatieve PCR (qPCR) wordt ook gebruikt buiten de medische diagnostiek voor biologisch onderzoek, zoals bij AQUON, een geaccrediteerd waterlaboratorium. Hier komt bij watergerelateerd onderzoek meer dan eens een kwantitatieve PCR om de hoek kijken. “We kunnen heel eenvoudig verschil tussen de DNA-typen – van de verschillende salamandersoorten – zichtbaar maken”, aldus Sander Heeman, senior moleculair analist.
Soms is sequencen van al het aanwezige DNA niet nodig. De interesse kan uitgaan naar enkele DNA-moleculen. Zo kijkt AQUON in Houten bijvoorbeeld naar de aanwezigheid van een vijftal salamanders in zoet water. Beperkt, maar heel belangrijk, want deze amfibieën zijn een indicator voor de biodiversiteit. Het beperkte aantal DNA-types is ideaal voor het toepassen van qPCR. Hoe doet AQUON dat? Een gesprek met Sander Heeman, senior moleculair analist bij AQUON.
QPCR identificeert salamanders
In Nederland komen vijf inheemse salamanders voor: de kamsalamander, kleine watersalamander, vinpootsalamander, vuursalamander en alpenwatersalamander. Daarnaast is een aantal salamanders als exoot waargenomen, bijvoorbeeld de Italiaanse kamsalamander.
Salamanders verspreiden zich door middel van de ecologische verbindingszones, die natuurgebieden aan elkaar koppelen. De Italiaanse kamsalamander vormt een bedreiging voor de inheemse Nederlandse kamsalamander. En er zijn ook al hybride salamanders waargenomen. Om dit stukje biodiversiteit in Nederland in de gaten te houden kijkt AQUON naar de aanwezigheid van deze salamanders en houdt het de exoten goed in de gaten. Dat doen ze met qPCR.
De Italiaanse kamsalamander vormt een bedreiging voor de inheemse Nederlandse kamsalamander | foto: Adobe Stock
Multiplex amplificatie
“We hebben van vijf van de in Nederland voorkomende salamanders een DNA-sequentie. Hierop hebben we primers en probes kunnen ontwerpen, zodat we een ‘multiplex’ amplificatie kunnen doen” [meerdere DNA’s tegelijk analyseren, red.], aldus Sander Heeman.
Hij vervolgt: “We amplificeren dus vijf sequenties tegelijkertijd in één multiplexreactie. De geproduceerde DNA-fragmenten zijn alle in de grootte van 114 tot 116 baseparen. We hebben een totaal van 9 verschillende primers nodig om deze fragmenten goed te maken.”
“Sommige sequenties staan niet in de database. We sequencen dan stukjes DNA waarop we onze primers en probes ontwerpen”
Sander Heeman, B.Sc., senior analist bij AQUON
Heeman heeft een Sybr-assay opgezet; hier komt geen probe aan te pas en de kleuring is op basis van een intercalerende kleurstof. Dat is een kleurstof die tussen de DNA-strengen gaat zitten.
AQUON gebruikt de kleurstoffen Sybr green en LC green, waarmee gevoeliger te meten is. Reden: LC green bindt aan elke base in een DNA streng, terwijl Sybr green dat niet doet. “Tijdens de amplificatiefase kun je het geproduceerde DNA, indien aanwezig in het monster, in real time volgen”, aldus Heeman.
Figuur 1: een smeltcurve plot van een salamander qPCR assay. Op de y-as de intensiteit van het signaal, op de x-as de temperatuur. De vijf geanalyseerde salamander-DNA’s geven verschillende smelttemperaturen aan, tussen de 84 en 88 °C, en zijn goed te onderscheiden van elkaar | foto: AQUON
Smeltcurve analyse
Het onderscheid tussen de salamandertypen wordt gemaakt in een smeltcurveanalyse, waarbij het gemaakte DNA uitsmelt naar de enkelstrengs vorm. Die uitsmelting gebeurt voor een bepaald stukje DNA altijd bij dezelfde temperatuur. Figuur 1 laat zien hoe zo’n analyse eruit ziet. Heeman: “We zien een verschil tussen de pieken van enkele graden. Dat betekent dat we heel eenvoudig verschil tussen de DNA-typen zichtbaar kunnen maken. Identificatie op deze manier is redelijk eenvoudig.”
“Smeltcurve analyse is een snelle en zeer robuuste methode om DNA te identificeren”
Sander Heeman, B.Sc., senior analist bij AQUON
De analyse beperkt zich niet tot salamanders. “AQUON kijkt ook naar bacteriën in slib. We kijken naar bepaalde soorten en doen een soortgelijke assay als voor de salamanders. Sommige zijn niet kweekbaar en een aantal staat nog niet in databases. Wij kunnen door smeltcurveanalyse echter zien dat bepaalde soorten aanwezig zijn.”
Met qPCR en de smeltcurveanalyse heeft AQUON een moleculaire analysetechniek in handen om snel en precies inventarisaties te maken van de biodiversiteit, of dat nu bacteriën betreft of hogere organismen. Er zullen ongetwijfeld meer toepassingen volgen.