Digitale PCR is een nieuwe vorm van de polymerase kettingreactie om DNA te kwantificeren. En hoe, want dPCR maakt bepaalde moleculaire diagnostiek die tot voor kort lastig was gemakkelijker. Deze digitale aanpak van PCR lijkt daarmee een belangrijke aanvulling te worden op de standaard PCR en realtime PCR.
dPCR maakt nieuwe wegen vrij in de moleculaire diagnostiek. Zo kun je tumoren onderzoeken en de enkele cellen analyseren die kanker-veroorzakende mutaties bevatten te midden van de vele gezonde cellen. Of je kunt DNA van zeldzame soorten in ecosystemen oppikken.
Krijgt dPCR voet aan de grond of is dit een ‘amplificatiebubbel’? Een hype is het zeker niet. In de afgelopen 15 jaar is de techniek ontwikkeld en de interesse groeit, zo blijkt uit de jaarlijks in PubMed gerapporteerde publicaties.
Dat aantal neemt sterk toe. De methode kent een belangrijk verschil met de standaard- en real time PCR. DPCR amplificeert de DNA-strengen in fysiek gescheiden ruimtes, waarbij elke streng dezelfde kans krijgt om te amplificeren.
In een standaard PCR is dat niet zo: bepaalde DNA-strengen hebben een grotere kans om te amplificeren, omdat er meer van aanwezig zijn. Dit gaat ten koste van de kleinere populatie, vaak interessantere, DNA-strengen. Elke streng zit dus in zijn eigen ‘bubbel’.
“Met dPCR kun je ook tumorcellen en verschillende witte bloedcellen specifiek kwantificeren in DNA-samples van diverse weefsels en lichaamsvloeistoffen”Wim Zoutman, senior onderzoeker dermatologie in het LUMC en pionier in de dPCR techniek
‘Digitale PCR vertegenwoordigt de derde generatie van PCR en maakt absolute kwantificatie mogelijk op het niveau van moleculen. De mogelijkheden zijn eindeloos: bijvoorbeeld detectie van zeer zeldzame mutaties in liquid biopsies of methylering van DNA.
‘Ook tumorcellen en verschillende witte bloedcellen kun je specifiek kwantificeren in DNA-samples van diverse weefsels en lichaamsvloeistoffen’, stelt Wim Zoutman, senior onderzoeker dermatologie in het LUMC en pionier in de dPCR techniek.
Digitale PCR kent al veel biologische en biomedische toepassingen. In 1993 werd de Nobelprijs uitgereikt voor de ontwikkeling van de PCR – nu met DNA-sequencing de meest gebruikte moleculair-diagnostische methode. Met de komst van real time PCR (qPCR), gebaseerd op fluorescentie, was de tweede generatie PCR-technieken geboren. Deze wordt nu dus alweer aangevuld door de laatste ontwikkeling op dit gebied – de third-generation PCR.
dPCR is op alle moleculaire terreinen in te zetten. Zo kun je bijvoorbeeld de aanwezigheid van exotische of bedreigde soorten in zoet water aantonen: hiervoor isoleer je al het DNA uit het water. Het gezochte DNA is soms in heel kleine hoeveelheden aanwezig ten opzichte van het overige aanwezige DNA1; dPCR is dan een goede oplossing.
In de medische diagnostiek is in 2016 een methode opgezet om in liquid biopsies (vloeistofbiopsies zoals bloedsamples), het cel-vrije DNA te analyseren op de aanwezigheid van borstkanker met dPCR.2 De duidelijke resultaten zijn vergelijkbaar met mammografie. De vloeistofbiopsies winnen de laatste jaren aan belang vanwege de waardevolle aanwezige genetische informatie.
Recent was er een publicatie over het aantonen van hartschade op genetisch niveau.3 In circulerend celvrij DNA konden onderzoekers duidelijke aanwijzingen voor schade vinden.
Bepaalde DNA-veranderingen, zoals methyleringen, waren ook met dPCR aantoonbaar. Het LUMC doet op grote schaal onderzoek met dPCR, bijvoorbeeld voor het aantonen van immuuncellen in tumoren4.
Virologen zetten dPCR in om nauwkeurig de hoeveel virusdeeltjes in keel-neus swabs aan te kunnen tonen5 – een antwoord dat met gangbare PCR-technieken niet verkregen kon worden.
dPCR wordt ook wel digital droplet PCR genoemd. Na isolatie van het DNA volgt vermenigvuldiging in een emulsie, gevolg door kwantificering van alle druppels op fluorescentie. Vandaar deze term. Een korte uitleg van de systematiek staat in figuur 1.
Emulsie PCR is op zich niet nieuw. Waarom is dPCR dan nieuw en waarom wordt de methode digitaal genoemd? Dat zit zo. Anders dan bij klassieke PCR worden bij dPCR alle DNA-strengen in afzonderlijke ‘hokjes’ geamplificeerd. Dit kunnen fysieke ruimtes zijn, maar vaak zijn het emulsie-druppels. Deze ontstaan door toevoeging van olie. Na juiste berekening en verdunning heeft elke druppel exact één DNA-kopie.
Dat is echter niet het hele verhaal. Er zijn ook druppels met 0 of 2 kopieën; een logisch gevolg van de Poissonverdeling – een methode uit de kansberekening.
Een voorbeeld van de Poissonverdeling: het aantal mailtjes dat je per uur ontvangt. Gemiddeld komt dat op een bepaald aantal neer, zeg 10, maar er kunnen uren zijn dat er wat minder of meer binnendruppelen. De meeste uren hebben hetzelfde aantal berichten. Als je dat grafisch zou weergeven krijg je de zogeheten klokvormige curve: het meest waarschijnlijke getal vormt de top van de curve.
De Poissonverdeling gaat ook op voor de DNA-verdeling over de druppels. En uit het aantal druppels zonder DNA bereken je de positieve druppels: heb je te veel of te weinig druppels zonder DNA, dan zijn je berekening en je verdunning niet goed geweest. Je hoeft bij dPCR dan ook geen ijklijn te maken, want je berekent met de Poissonverdeling het aantal druppels dat positief is.
De uitgevoerde PCR is een standaard qPCR. Maar het grote verschil met een reguliere PCR is dat er met fluorescentie bekeken wordt of het DNA vermenigvuldigd wordt. Kortom, een ja/nee resultaat in plaats van een bepaald getal. Net als de nullen en enen die een computersysteem toekent. Met als voordeel voor de onderzoeker: je meet individuele moleculen.
“dPCR wordt ook wel digital droplet PCR genoemd”
Kun je nu met dPCR exacter meten? Het antwoord is ‘ja’. Bij klassieke PCR worden alle DNA-moleculen gelijk geamplificeerd. Maar de kans om die ene afwijkende DNA-sequentie op te pikken in de aanwezigheid van tienduizenden normale DNA-sequenties is vrijwel nul. Bij dPCR is dat wel mogelijk: de afwijkende sequentie zal altijd een positief signaal geven omdat er geen concurrentie is van andere DNA-sequenties. Want zoals gezegd, elk DNA-molecuul zit in de eigen ‘amplificatie-bubbel’.
dPCR is nog nieuw en validatie is nog een dingetje. Maar hier wordt aan gewerkt: het is nu wachten op een groot aantal gevalideerde en door de FDA en EMA goedgekeurde dPCR-methodes. Dat zal niet lang meer duren, gezien het grote aantal artikelen en goed uitgewerkte methodes.
Een protocol voor detectie van SARS-CoV-2 heeft al FDA-goedkeuring en wordt door het bedrijf PreciGenome op de markt gebracht. Voor wie meer wil lezen over deze interessante moleculair-diagnostische techniek: er zijn goede reviews (bijvoorbeeld dPCR: A Technology Review – PMC (nih.gov)). Bedrijven die dPCR leveren zijn onder andere BioRad en Qiagen.
Kortom, eigenlijk staat er weinig in de weg om dPCR te gaan toepassen. Of er in elk geval vast kennis van te nemen. Het is niet moeilijk te leren – wel dien je ervaring op te doen met de interpretatie. En troubleshooting en optimalisatie zijn uiteraard van belang.
“Kun je nu met dPCR exacter meten? Het antwoord is: ja”
