Word een PCR-expert, ontwerp je eigen probes

Een PCR uitvoeren kan iedereen met een beetje biomoleculaire labskills. Een kenner word je pas als je snapt hoe een primer en een probe ontworpen worden. Wil je dat in de vingers krijgen? Dan zijn dit een paar basale regels om in acht te nemen bij het ontwerpen van een oligo.

5 Probe design-tips

Dit zijn de ontwerpregels voor het design van je eigen oligo’s. Houd je eraan, anders werkt je probe mogelijk niet goed.

1. Zorg voor een mooie GATC-spreiding, dus een random verdeling
2. Kies de smelttemperatuur van forward- en reverseprimers ongeveer gelijk
3. Kies de smelttemperatuur van de probes vijf tot tien graden boven die van de primers
4. Zorg dat de polymerase aan een stabiel stukje DNA bindt: een G of C ergens aan de 3’ kant van de primer maakt het steviger dan een stukje met alleen A en T
5. Ontwerp de primers met 18-24 nucleotiden; maak probes enkele nucleotiden langer dan de primers

Doe-het-zelf oligonucleotiden pakket

Tot zover de regels. Je weet nu waarop je moet letten als de software voor jou aan het werk gaat! Er zijn commerciële pakketten, maar begin gewoon eens met primer3plus. Het wordt wereldwijd gebruikt en ontwerpt prima primers. Ook probes kun je hiermee ontwikkelen, maar het programma heeft daar wat meer moeite mee. Wil je zonder software ontwikkelen? Houd je aan bovenstaande regels! En bereken de smelttemperatuur, belangrijk voor de annealingtemperatuur in je PCR, met een online analyse programma. De keuze hierin is ruim; kies het rekenprogramma dat je past; soms dien je een account aan te maken.

Doe altijd de primer check

Zijn je ontworpen primers nu echt goed? Gaan ze amplificeren wat je wilt? En zijn ze specifiek, zodat ze het juiste fragment aankleuren? Allemaal vragen die grotendeels te beantwoorden zijn door een ‘BLAST’ uit te voeren. Met deze methode, te vinden onder de NCBI server, zoek je in een database van zo’n 100 miljoen sequenties (!) of jouw primer het juiste stuk aanmaakt.

Hoe gaat dit in zijn werk? Copy/paste je sequentie in het query venster en klik op BLAST. Je krijgt een lijst van sequenties die jouw primers en probe sequenties herkennen en daarmee meteen de resultaten die je zoekt. Natuurlijk kun je ook BLAST expert worden, maar om te beginnen hoef je niet meer te weten. Makkelijk, toch?

Met de Primer-BLAST-tool worden primers en probes snel en automatisch ontworpen. Het voordeel hiervan is dat er bij het ontwerp direct een specificiteit-check gedaan wordt. Het nadeel is dat je iets minder controle op het ontwerp hebt – bij primer3plus kun je de settings wat meer tweaken. De ervaring leert dat beide tools prima werken, maar dat het in tweeën splitsen van het proces (oligo design en BLAST check) iets meer controle geeft over het ontwerp en daarmee de voorkeur heeft.

Valkuilen bij primer- en probe-ontwerp

Het klinkt alsof het juist ontwerpen van primers en probes garantie geeft op succes. Maar dat is niet altijd zo. Bedenk dat oligo’s chemische moleculen zijn. Het kan bijvoorbeeld zo zijn dat de forwardversie net wat sneller of langzamer bindt dan de reverse. De smelttemperatuur mag dan gelijk zijn, toch is er dan geen 100% goede aanmaak van nieuw DNA. Dat wordt overigens pas een probleem als de PCR veel te weinig nieuw DNA oplevert.

Bij een ‘multiplex’-PCR zijn er meerdere primer- en probeparen. Zo toon je meerdere stukjes DNA tegelijk aan. Deze primers en probes kunnen helaas soms aan elkaar binden en de amplificatiereacties verstoren. Of de probes zijn niet voldoende specifiek. Dat maakt het opzetten van een multiplex lastig. Er komt veel uittesten bij kijken.

Tot slot zijn er vele fluorescente ‘groepen’ ontwikkeld. Houd er rekening mee dat deze soms ook verschillend in fluorescentie-intensiteit kunnen zijn. De probe levert dan meer of minder signaal op dan je had gehoopt. Wil je meer weten of eens oefenen? Check een aanbieder van cursussen op dit gebied.

Checklist doe-het-zelf primers en probes

• Ontwerp je primers met gratis of commerciële software
• Probes kun je het beste ontwerpen met een commercieel pakket
• Primers bepalen de eerste laag van specificiteit: het juiste stuk wordt aangemaakt
• Probes bepalen de tweede laag van specificiteit: alleen het juiste stuk wordt zichtbaar gemaakt
• Amplificeer je, ongewenst, meerdere producten? Check de smelttemperaturen van primers en probes. Pas eventueel de annealing temperatuur in de PCR aan.