Sybr Green bindt aspecifiek aan DNA. Geen probe, maar een kleurstof.
Wie qPCR uitvoert, weet dat correcte oligonucleotides – primers en probes – belangrijk zijn. Dit maakt het verschil tussen wel of niet een duidelijk en specifiek signaal. Hoe werken oligo’s nu precies, hoe maak je ze specifiek en waarom zijn ze cruciaal voor de PCR-amplificatie?
Na de stormachtige opkomst van de moleculaire biologie in de jaren zeventig werd in de jaren tachtig de PCR aan het technologische arsenaal toegevoegd. En daarmee werden opeens de ‘oligonucleotiden’ heel belangrijk.
Oligonucleotiden, ofwel oligo’s, zijn korte stukjes nucleotiden die we kunnen maken met een machine. Primers en probes, gebruikt in PCR, zijn een vorm van zulke oligo’s. Vroeger werden probes met name ingezet om DNA of RNA aan te tonen – bijvoorbeeld in cellen of weefsel. Maar bij PCR kregen ze een nieuwe rol: zorgdragen voor het zichtbaar maken van DNA dat met behulp van primers wordt aangemaakt. Daarmee zijn ze cruciaal voor de PCR-amplificatie.
Oligo’s hoeven niet lang te zijn
Over amplificatie gesproken: een oligo kent een bepaalde volgorde van adenine, guanine, cytosine en thymine. De kans dat je een volgorde van vier van deze nucleotiden in het DNA aantreft, is groot: 1 op de 250 – in ons genoom kom je dit stukje dan 12 miljoen keer tegen. Heb je een oligo van 21 nucleotiden, dan is de kans dat je deze exacte volgorde in het DNA aantreft nog slechts één op de vier miljard. Je treft zo’n stukje dus ook maar één keer aan in het hele menselijke genoom! Aangezien ons DNA specifieke en minder specifieke stukken bevat, zitten we met oligo tussen de 18 en 24 nucleotiden altijd goed.
“Een specifieke primer is belangrijker dan een specifieke probe. Deze bepaalt wat aangemaakt wordt. Aantonen kan vervolgens met probes, maar ook op andere manieren”
Dr. Rob van Gijlswijk, manager bij het Waterlaboratorium
DNA-fragment matchen met probes
In een eerder stuk besprak Labinsights de qPCR (kwantitatieve PCR). Met deze techniek kun je direct zien of je het juiste stuk DNA aanmaakt. Al tijdens de amplificatie met de juiste probes en niet pas achteraf met de smeltcurve. Hoe zit dat? De primers zorgen ervoor dat je het juiste stuk DNA amplificeert. Ze bepalen de grenzen van het stuk dat je aanmaakt. Het aanmaken van het juiste stuk wordt bevestigd met de probes. Deze zijn namelijk zo ontworpen dat ze precies het DNA matchen. Heb je een aspecifiek stuk gemaakt, dan wordt het dus niet zichtbaar gemaakt.
Figuur 2: Een taqman probe bindt aan DNA | foto: BioRad, Introduction to PCR Primer & Probe Chemistries
Fluorescentie maakt DNA zichtbaar
Het zichtbaar maken van DNA in qPCR kan op meerdere manieren: non-specifiek door het laten binden van een kleurstof, zoals Sybr green (zie figuur 1, afbeelding bovenaan artikel), maar dat is geen probe. Een hydrolyseprobe is dat wel, en heeft een ‘lichtgevend’ stukje (dat fluoresceert) en een ‘uitdovend’ deel (de zogeheten quencher, zie figuur 2). Wanneer de probe aan het DNA bindt, geeft hij geen licht. Echter, wanneer de polymerase het DNA gaat aanmaken (zie ook het stuk over PCR), breekt hij de probe af. Dat activeert de fluorescentie, waarop de probe zijn lichtsignaal afgeeft.
Figuur 3: Moleculaire beacons geven pas fluorescentie af na het binden aan DNA | foto: BioRad, Introduction to PCR Primer & Probe Chemistries
De aanmaak van DNA leidt dus tot verhoging van het fluorescentiesignaal, en is in real time zichtbaar te maken met bepaalde software. Naar Pacman uit de gamewereld wordt dit type probe van oudsher ‘Taqman’ probe genoemd.
Er zijn meerdere soorten probes die van fluorescentie gebruiken maken: beacons zijn ‘opgevouwen’ totdat ze hun doelwit-DNA binden. Dan wordt er licht uitgestraald. Zie ook figuur 3. Hybridisatieprobes werken weer anders: ze bestaan uit twee oligo-delen die voor extra specificiteit zorgen. Beide oligo’s dienen te binden en stralen elkaar bij juiste binding aan. Of doven elkaar uit, als het systeem zo is opgezet. Deze probes worden ook wel FRET-probes genoemd, naar het mechanisme ‘Fluorescence Resonance Energy Transfer’. Er wordt energie overgedragen van de ene naar de andere probe, die wordt als licht wordt uitgezonden, zoals in figuur 4.
Figuur 4: 'FRET probes (hybridisatieprobes) stralen elkaar aan bij juiste binding | foto: BioRad, Introduction to PCR Primer & Probe Chemistries
Probes specifieker maken
Er is veel geëxperimenteerd met probes om ze nog specifieker of meer toepassingsgericht te maken. Virussen bijvoorbeeld kennen soms maar korte stukjes DNA waarin ze van elkaar verschillen. Je probes dienen dus kort te zijn. Er zijn wat chemische trucs bedacht om de probes dan toch goed te laten binden en een goede specificiteit te behouden. Een daarvan is het toepassen van ‘locked nucleic acids’ (LNA’s). Deze hebben een hogere affiniteit en binden sterker. Moderne software, bijvoorbeeld van het bedrijf Premier Biosoft, helpt je bij het ontwerpen ervan.
“Je probe levert weliswaar een groot specificiteit-voordeel op, maar je PCR gevoeligheid kan achteruitgaan. Immers, dat wat je niet zichtbaar kunt maken met je probe, omdat je het aspecfiek aanmaakt, beïnvloedt wel je specifieke PCR”
Dr. Rob van Gijlswijk, manager bij het Waterlaboratorium
Scorpion Primers
Creatieve onderzoekers hebben zelfs oligo’s ontwikkeld die op een heel speciale wijze binden: de ‘scorpion primers’. De binding werkt als de staart van de schorpioen: het achterste gedeelte van de oligo gaat tijdens de PCR over het voorste gedeelte en bindt aan het DNA. Het werkt daar als primer en aanmaak van nieuw DNA vindt plaats. De primer bevat ook meteen de kleurstof en een probe is niet nodig. Zo wordt er steeds van alles geprobeerd om assays goedkoper en specifieker te maken. Dit chemisch ontwerpen van oligo’s is een vak apart.
