PCR blijft topper in de moleculaire diagnostiek

Elk moleculair biologisch laboratorium dat diagnostiek doet, kan niet zonder de PCR-methode. Snel te leren en de reagentia zijn betaalbaar. Eigenlijk is de methode ontworpen om voldoende DNA te verkrijgen om goed te kunnen analyseren. Over het uitvoeren van de methode verderop in het stuk meer.

Wat heb je nodig? Het minimale beetje DNA dat je wil vermenigvuldigen, de ‘primers’ – de beginstukjes waar de vermenigvuldiging start – een enzym (Taq polymerase), nucleotiden en wat buffer. De vermenigvuldiging wordt amplificatie genoemd. Omdat het octrooi op de methode en Taq polymerase verlopen is, zijn er vele leveranciers en zijn de prijzen van reagentia laag. Dit maakt PCR tot een aantrekkelijke, want betaalbare en betrouwbare methode voor veel laboratoria.

Nobelprijs voor PCR

De Nobelprijs werd in 1993 aan Kary Mullis uitgereikt voor de ontdekking van de PCR. Een logische prijs, want het zou een van de meest gebruikte methodes worden in de moleculaire biologie.

Wat is de essentie? Er was al bekend dat DNA kon uitsmelten naar de enkelstrengs structuur en kon terugkeren naar de dubbelstrengs vorm. Dat proces is temperatuurafhankelijk. Wanneer de enkelstrengs structuur ontstaat, dan kun je daar handig gebruik van maken door een nieuw stukje DNA aan te maken op de uitgesmolten strengen. En de startpunten voor de aanmaak kun je zelf bepalen door specifieke primers – ontworpen op een bepaalde sequentie – te laten binden. Op deze manier is het mogelijk om in no time exponentieel DNA aan te maken: elke cyclus geeft een verdubbeling van DNA.

Snelle vermenigvuldiging van weinig DNA

Cruciaal voor de PCR-amplificatie van DNA is een heel bijzonder enzym, Taq polymerase. Dit maakt onder hoge temperatuur (72 graden Celsius) nieuw DNA aan.

Het team Mullis gebruikte bij de ontwikkeling van de methode een enzym dat in 1976 beschreven werd door de Amerikaanse Alice Chien. De bacterie die het enzym maakt, Thermus aquaticus, was al eerder ontdekt in Yellowstone National Park door microbioloog Thomas Brock. Een belangrijke ontdekking dus, die pas in de jaren tachtig een grote toepassing kreeg.

Stapsgewijs ziet PCR er zo uit:

1. Stap 1:
   Door DNA eerst uit te smelten (bij 95 °C) breng je het in de enkelstrengs vorm. Dit heet denaturatie.
2. Stap 2:
   Vervolgens verlaag je de temperatuur naar de temperatuur waarbij de primers hechten: meestal rond de 55 °C, en wel precies op de plaats waar jij dat wilt. Deze stap heet annealing en is bepalend voor het aanmaken van het juiste DNA.
3. Stap 3:
   Tot slot laat je bij 72 °C een nieuw fragment aanmaken door Taq polymerase. We noemen dit de extensie of elongatie.
4. Stap 4:
   Het geheel herhaal je zo’n 30 keer en het resultaat is dat je je gewenste DNA-stukje tot een miljoen keer vermenigvuldigt!

Ofwel, van een picogram kun je naar microgram hoeveelheden DNA gaan. Theoretisch zou je nog verder kunnen amplificeren, maar er treedt op een bepaald moment remming van de PCR op.

De Thermocycler: niet zomaar een simpele temperatuurwisselaar

Het cyclisch amplificeren doe je in een thermocycler, die je al vanaf een paar duizend euro koopt. Eigenlijk is het een apparaat dat van temperatuur wisselt. Maar een goede, niet te goedkope, cycler doet dat wel heel precies en voor elk monster op dezelfde manier. En hij wisselt heel snel van temperatuur. Een goedkope cycler is dus niet altijd de beste keuze.

Er is veel keuze op de markt en het loont om apparaten vooraf te testen. Goede apparaten beschikken ook over een ‘gradiënt’ functie: ze kunnen over het thermoblock een verschil in temperatuur aanbrengen. De bovenkant van het blok is dan tijdens de annealing bijvoorbeeld iets minder warm dan de onderkant. Je kunt dan je samples bij verschillende temperaturen PCR’en en daarmee je assay optimaliseren.

Voorkom contaminatie bij een PCR

Vervuild PCR leidt tot foutieve resultaten: zuiver werken heeft dus topprioriteit. Het feit dat PCR een hypersensitieve methode is – indien er DNA aanwezig is, dan wordt het ‘opgepikt’ – maakt dat je enorm moet uitkijken voor contaminatie. Weliswaar borg je met je primers welk stuk je vermenigvuldigt, maar aspecifieke vermenigvuldiging ligt op de loer.

Eigenlijk is de methode niet zo heel moeilijk: de wijze van werken is het meest van belang. Met het uitvoeren van een PCR in ultracleane reagentia – denk bijvoorbeeld aan bestraald water en hoogste zuiverheid chemicaliën – zijn veel problemen te voorkomen.

Vele wegen leiden naar DNA-amplificatie

De PCR kent intussen meerdere loten aan de stam:

• Klassieke PCR (hiervoor beschreven)
• qPCR
• Digitale PCR

Bij qPCR, ook wel realtime PCR genoemd, kun je het amplificatieproces op een beeldscherm volgen. Je kunt dan direct zien of je DNA gemaakt wordt, maar je kunt ook bijvoorbeeld op mutaties screenen. Het gemuteerde stuk wordt niet aangemaakt, maar het niet-gemuteerde stuk wel. Ook kun je DNA identificeren aan de hand van temperatuur eigenschappen: stukken met verschillende nucleotiden samenstelling smelten onder verschillende temperaturen uit. En die verschillen kun je eenvoudig zichtbaar maken.

Digitale PCR is de nieuwste ontwikkeling. Het is gericht op het meten van individuele DNA-moleculen. Dus: DNA-moleculen uit elke cel van een stukje weefsel worden ieder apart geamplificeerd. Zo zijn ze allemaal individueel ook zichtbaar te maken.

Overal waar DNA is, komt PCR om de hoek kijken

Of je nu werkt in forensische wetenschap, pathologische diagnostiek, moleculairbiologisch onderzoek of environmental DNA: in elke tak van sport komen we PCR tegen. Zo kun je zelfs uit opgedroogd bloed, gevonden op bijvoorbeeld een stoeptegel op een plaats delict, met veel moeite soms nog DNA amplificeren. En daarna analyseren, waar het natuurlijk om gaat. Of die ene tumorcel genetisch onderzoeken die zich in een populatie van vele tienduizenden cellen bevindt.

Momenteel wordt er ook veel klimaatonderzoek gedaan, waarbij gekeken wordt naar invasieve soorten. Denk bijvoorbeeld aan de Amerikaanse rivierkreeft of de vele soorten grondels, baarsachtigen, die nu in onze wateren zitten. Ze laten allemaal DNA-sporen na die we met PCR kunnen vaststellen.

PCR, sequencing en drones

Op veel plaatsen wint het DNA sequencen terrein. De reden daarvoor is dat de gehele nucleotidesequentie bepaald wordt en je dus meer informatie krijgt. Bovendien kun je, bij next generation sequencing, meteen grote aantallen genen tegelijk analyseren. Vanzelfsprekend is dit ook een duurdere methode dan een PCR.

Toch zijn er redenen genoeg om niet alles te sequencen: soms wil je gewoon vaststellen of een bepaald stukje DNA aanwezig is. Een eenvoudige PCR, die niet al te duur is, kan dan uitkomst bieden. Het sequencen van al het mogelijk aanwezige DNA is dan een overkill en een stuk prijziger. Daarnaast is een PCR heel gevoelig en net zo betrouwbaar als sequencing. Ook maken veel sequencing-methoden nog steeds gebruik van een PCR-stap om het DNA eerst te vermenigvuldigen.

Is een PCR-methode correct opgezet, dan pik je eigenlijk altijd datgene op wat je zoekt. Bovendien wordt PCR steeds gebruiksvriendelijker en zijn er al handheld devices. PCR wordt zelfs op drones uitgevoerd – waarbij de wisseling van temperatuur een aandachtspunt is – bijvoorbeeld in afgelegen gebieden. PCR blijft dus voorlopig nog wel even.