Kwantitatieve PCR: de tweede generatie PCR - Labinsights

Kwantitatieve PCR: de tweede generatie PCR

icon.highlightedarticle.dark Tech & Analyse
103 bekeken Laatste wijziging: 28 januari 2025
Realtime PCR voor de identificatie van pathogenen, bacteriën, virussen, inclusief Covid19
Realtime PCR voor de identificatie van pathogenen, bacteriën, virussen, inclusief Covid19 | Foto: Adobe Stock

De ‘klassieke’ PCR uit de jaren tachtig werd kwantificeerbaar met qPCR. Kwantitatieve PCR gebruikt fluorescerende verbindingen en biedt veel voordelen. Met de vermenigvuldiging van DNA kun je én in real time meten én meteen een identificatie van je product doen.

Daarmee is Kwantitatieve PCR (qPCR), een vooruitgang ten opzichte van de door Kary Mullis bedachte polymerasekettingreactie. qPCR mag dus met recht de tweede generatie van de PCR genoemd worden.

Polymerasekettingreactie niet kwantificeerbaar

In de jaren negentig had men al snel door dat het niet kunnen kwantificeren van de polymerasekettingreactie (PCR), een speerpunttechnologie in de moleculaire biologie, een zwak punt van de techniek was. Je kunt heel veel met PCR, maar er zijn ook veel toepassingen waarbij kwantificeren nu net wel belangrijk is. Denk aan het monitoren in de diagnostiek van aantallen virusdeeltjes in hiv-patiënten, of meten hoeveel blauwalg precies aanwezig is in zwemwater.

Het aantal deeltjes per ml vloeistof kan zomaar oplopen van 10 naar 10¹⁰. Een gewone PCR is een ‘eindpuntmeting’, kwantificeert niet en kan zeker niet overweg met grote verschillen in DNA-input concentratie. Een qPCR kan dat allemaal wel: de ‘dynamische range’ is veel groter. Hoe werkt deze fascinerende technologie?

Oorsprong van qPCR

Om de qPCR te begrijpen moeten we terug naar het analyseren van de klassieke PCR. Na het amplificeren (vermenigvuldigen) van DNA tijdens de PCR cycli, wordt het gevormde product op een agarose gel (of op een lab-on-a-chip systeem) geanalyseerd. Dit noemen we een eindpunt meting. Er wordt op de gel naar grootte van het DNA-bandje gekeken. Voor het zichtbaar maken gebruikt men een fluorescerende kleurstof. Deze geeft een kleur onder blauw of uv-licht. De kleurstof neemt dit op en geeft zichtbaar licht af, respectievelijk absorptie en emissie.

“qPCR: fluorescerende revolutie in de microbiologische diagnostiek”

Fluorescentie is de basis bij qPCR

Deze fluorescerende stoffen zijn de basis van de qPCR. Ze worden al toegevoegd tijdens de PCR. Door deze kleurstof tijdens het proces van DNA aanmaak zichtbaar te maken – in real-time dus – wordt de hoeveelheid DNA meetbaar. Oorspronkelijk heette de methode dan ook real time (RT) PCR, maar deze term wekte verwarring. Er bestaat namelijk ook een reverse transcriptase enzym, dat niets met PCR te maken heeft. En dus werd het quantitative (q)PCR.

Intercalerende stoffen maken DNA zichtbaar

Hoe maakt die kleurstof het DNA nu zichtbaar? Er zijn een paar belangrijke methoden, alle gebaseerd op affiniteit, een maat voor de sterkte van de onderlinge binding van stoffen. Methode 1 is toepassing van intercalerende stoffen. Dit zijn de stoffen die tussen DNA-strengen gaan zitten, en daarmee dubbelstrengs DNA zichtbaar maken. Ze nestelen zich in de helix structuur van het DNA. Enkelstrengs DNA wordt wel gebonden, maar met een heel erg lage affiniteit en is dus nauwelijks zichtbaar. Zo wordt elk stukje dubbelstrengs DNA aantoonbaar.

“qPCR, de kwantitatieve ‘lifesaver'”
Dr. Eric Claas, medisch moleculair microbioloog, LUMC

Probes kleuren DNA specifiek

Methode 2 in qPCR is DNA zichtbaar maken met oligonucleotide probes. Deze hebben een tegengestelde sequentie aan het stukje van interesse. Bij vorming binden de probes aan het DNA. Hoe meer DNA, hoe sterker het signaal. De probes dragen een fluorescerende groep die alleen dat wat specifiek bindt aan de probe zichtbaar maakt. Hierin zit het verschil met intercalerende stoffen. De rest van het DNA wordt niet gebonden. Dus, zie je niet wanneer een aspecifiek stuk DNA wordt geamplificeerd. Maar misschien wil je dat ook wel niet zien; daar kunnen best goede redenen voor zijn.

tk2

Een PCR of een qPCR uitvoeren

Wanneer je een qPCR gaat doen, dan lijkt dat op het uitvoeren van een PCR. Met het verschil dat de qPCR-buffer en de qPCR-mix een klein beetje anders zijn. De mix bevat bijvoorbeeld een intercalerende stof zoals Sybr Green of LC Green. Of je gaat dus voor een probe. In de qPCR buffer zit ook iets meer magnesium.

De cycling zelf wordt in een qPCR in een tweestaps versie uitgevoerd. Dat betekent dat er een uitsmelting plaatsvindt bij 95°C, gevolgd door een gecombineerde ‘annealing’ (het binden van de primers) en ‘extensie’ – het aanmaken van DNA door een polymerase enzym. Die gecombineerde stap gebeurt meestal rond de 62°C. Op het scherm kun je de aanmaak van DNA per cyclus volgen. Elk gevormd deeltje wordt door de fluorescerende stof gebonden en zichtbaar gemaakt.

qPCR heeft groter dynamisch meetbereik

Veel of weinig input, een qPCR kan het meten. Een klassieke PCR meet alleen het eindpunt, namelijk hoeveel er gevormd is. Dat zegt niets over hoeveel DNA er in de reactie werd gestopt. Verder is bij PCR de range van een eindpuntmeting (het meetbereik van een analytische gel) vele malen kleiner dan de range van een qPCR.

Zo meet je in een klassieke PCR hoeveelheden in de orde van nanogrammen tot microgrammen. Dat zijn 3, maximaal 4 ‘ordes van grootte’. Een qPCR kan echter een input meten van een paar moleculen, maar meet ook een paar biljoen moleculen – dat zijn negen tot tien ordes van grootte! QPCR heeft dus een veel grotere ‘dynamische range’. Om te kwantificeren wordt een ijklijn gemaakt. Een bekende serie concentraties wordt gemeten en hieraan worden de onbekende samples bepaald.

Bepaling van input DNA is bijvoorbeeld van belang bij hiv-patiënten die grote verschillen van aantal virusdeeltjes in het bloed te kunnen laten zien. qPCR is voor deze patiëntengroep de ideale techniek voor het monitoren van de ‘viral load’ op een bepaald moment in het ziekteproces.

Een smeltcurve plot van een salamander qPCR assay. Op de y-as de intensiteit van het signaal, op de x-as de temperatuur. De vijf geanalyseerde salamander-DNA’s geven verschillende smelttemperaturen aan, tussen de 84 en 88 °C, en zijn goed te onderscheiden van elkaar
Een smeltcurve plot van een salamander qPCR assay. Op de y-as de intensiteit van het signaal, op de x-as de temperatuur. De vijf geanalyseerde salamander-DNA’s geven verschillende smelttemperaturen aan, tussen de 84 en 88 °C, en zijn goed te onderscheiden van elkaar | foto: AQUON
tk4

De smeltcurve is de bonus

Een grote plus van qPCR ten opzichte van klassieke PCR is de smeltcurve na afloop. Hiertoe laat je het gevormde product uitsmelten bij oplopende temperatuur en plot de ‘DNA-smelt’ tegen de temperatuur. Bepalend voor de smelttemperatuur zijn de samenstelling van het DNA – de hoeveelheid en spreiding van A, G, T en C nucleotides – en de lengte van het stuk DNA. In de software wordt het uitsmeltsignaal weergegeven als een piek, die bij een specifieke temperatuur optreedt. Die temperatuur is uniek voor het gemaakte stuk DNA. Moleculair biologen gebruiken deze smeltcurve veel: het maken kost slechts 20 minuten meer dan de PCR-methode en geeft je, als bonus, veel informatie.

tk1

Troubleshooting bij qPCR

De grote leveranciers van qPCR apparatuur hebben alle troubleshooting manuals op internet gezet. Deze geven niet alleen waardevolle tips, maar leiden de gebruiker van de methode door het gehele qPCR proces heen. Zo is het bijvoorbeeld oppassen met het gebruik van controles. Omdat qPCR heel erg gevoelig is, komen alleen controles in aanmerking die zich min of meer in dezelfde omstandigheden bevinden als het te analyseren DNA, en die dezelfde primers binden. Die zijn helemaal oké.

Veel andere niet. Analyseer je bijvoorbeeld genomisch DNA met plasmide DNA als controle, dan introduceer je al een verschil. En heeft een controle een PCR-remmer, dan mag je al niet meer vergelijken. Sommige stoffen hinderen de fluorescentie, andere versterken deze. En zo zijn er meer addertjes onder het gras.

Primers en probes

De juiste keuze van primers en probes is essentieel bij qPCR. Ze dienen zo opgezet te worden dat ze niet aan elkaar binden, maar alleen aan het DNA. Daar is goede software voor. Ook moeten de smelttemperaturen van primers bij elkaar liggen en die van de probe er iets boven. De probe dient namelijk het DNA iets langer te binden tijdens de amplificatie.

tk3

Software, treshold settings en Cq waarden

De interpretatie van qPCR curves is ook bijzonder belangrijk: software-instellingen waarmee de drempel (de ‘treshold’) wordt vastgesteld, kunnen het verschil maken tussen een positief of negatief resultaat. Er zijn nogal wat wiskundige analysemethoden op de interpretatie los te laten. Over de Cq waarde, de drempelwaarde waarbij een signaal optreedt en die in de diagnostiek gerapporteerd wordt, is zelfs een apart artikel te schrijven. Er is veel literatuur over deze Cq waarde.

PCR op meerdere DNA-targets

Tot slot de kers op de taart in qPCR land: het opzetten van een multiplex qPCR, waarbij je naar een aantal verschillende DNA-targets in één reactie kijkt. Nog steeds een goed alternatief voor next generation sequencing, als je voldoende hebt aan de analyse van een paar DNA-sequenties. Het is bovendien veel goedkoper dan next generation sequencing.

Maar er komt veel bij kijken: hoe meer primers, hoe lastiger het is om ze individueel te ontwerpen. Smelttemperaturen moeten kloppen, want niemand wil interacties van primers met hun soortgenoten. Een goede cursus op dit gebied is een aanrader, want qPCR luistert nauw. En heb je de qPCR onder de knie, dan kun je meteen door met de derde generatie PCR: de digitale PCR. De ontwikkelingen in de PCR gaan nog wel even door.

Lees meer over (q)PCR:

qPCR bij AQUON: over salamanders en 16S DNA

Blijf op de hoogte en mis geen artikel

Abonneren icon.arrow--dark