Inzetten van een plaat voor PCR-cycling | Foto: Marc van Nierop, Fontys Toegepaste Natuurwetenschappen
Voor toepassing van PCR, nog altijd een van de belangrijkste moleculair-diagnostische methodes, zijn (thermal) cyclers onontbeerlijk. Een overzicht van de laatste trends en ontwikkelingen in PCR-machines.
tk1 Zonder thermocycler geen PCR, geldt vandaag de dag. Maar dat is niet altijd zo geweest. In de jaren tachtig werd de PCR-methode opgezet zonder geavanceerde machines. Het principe van amplificatie in een buisje gebeurde in waterbaden met verschillende temperaturen. Het verplaatsen van tubes van het ene waterbad naar het andere was arbeidsintensief – je moest immers met de hand je monsters zo’n 120 keer verplaatsen – dat duurde wel 4 tot 5 uur.
Een ‘thermostabiel’ enzym was in die dagen niet voorhanden en buffers waren nog lang niet honderd procent geoptimaliseerd. Het enzym diende per cyclus opnieuw toegevoegd te worden. Er was dus ruimte voor verbetering. Noodzakelijk, gezien de vlucht die PCR zou gaan nemen.
Vroege versie van een PCR-machine (ca. 1992), een zogenaamde ‘Gene machine’ gemaakt door Innovonics. Er zijn drie thermische baden voorzien van een specifieke constante temperatuur. Een robotarm verplaatste de monsters van bad naar bad | foto:Wikipedia
tk2 Eerste thermo-cycler
Rond 1987, vlak na de ontwikkeling van de PCR-methodiek, kwam de eerste PCR cycler op de markt door een samenwerking tussen de bedrijven Perkin-Elmer en Cetus. De ‘PCR -1000 Thermal cycler’ was geboren en gebaseerd op ‘peltier verhitting’. Cyclers maken voor verhitting en afkoeling gebruik van een paar technologieën, en dat was bij dit eerste toestel ook al zo. Te weten:
- Peltier-elementen
- Rotorsystemen
- Weerstandsverhitting
Peltier-effect
De eerste thermocyclers maakten dus gebruik van het ‘peltier-effect’. Dit is een snelle temperatuurverandering die optreedt als er een elektrische stroom door een thermo-elektrisch element gaat – een lood-telluur (PbTe) verbinding. Dit effect werd in 1834 door de natuurkundige Jean Charles Athanase Peltier beschreven.
Het peltier-effect maakt de voor PCR belangrijke snelle temperatuurwisselingen mogelijk. Dit voorkomt aspecifieke amplificaties bij overgangstemperaturen. De tijd benodigd voor temperatuurwisseling heet de ‘ramp’ tijd. Hier geldt: hoe korter, hoe beter. Peltier-technologie is in de meeste PCR-machines aanwezig.
Analiste Annelieke van Bergen zet een PCR in op het lab van Fontys | foto:Marc van Nierop, Fontys Toegepaste Natuurwetenschappen
tk3 Draaiende cyclers
Een aantal fabrikanten heeft machines ontwikkeld met heel lage ramps. Zo maakte de eerste light cycler van Roche gebruik van een rotor met glazen buizen. De wisseling van temperatuur was snel, maar het gebruik van glas had z’n nadelen. Buizen braken nogal eens tijdens de sample handling.
De Rotorgene, ontwikkeld door het Australische Corbett en nog te verkrijgen via Qiagen, maakt gebruik van plastic tubes in combinatie met het rotor-verhitting principe. Lucht wordt in dit apparaat verhit en door de draaiende rotor constant gehouden voor alle samples. Voordelen: snelle temperatuurwisseling en een zeer lage variatie in de monstertemperatuur. Prijs voor het basismodel: om en nabij de € 20.000.
Inzetten van een plaat voor PCR-cycling | foto:Marc van Nierop, Fontys Toegepaste Natuurwetenschappen
Mini en maxi PCR-machines
Er is momenteel een ontwikkeling naar kleinere apparaatjes gaande. Deze miniPCR machines gebruiken resistive heating, ofwel verhitting door een stroom die door een weerstand gaat. Zoals de leverancier zegt: van klaslokaal tot jungle, overal bruikbaar. Prijzen vanaf 600 euro.
Voor wie met klein niet uit de voeten kan, zijn er hogecapaciteits-toestellen. Molgen levert de Aquacyclers 16 en 32, die vele duizenden samples tegelijk kunnen runnen. Hiermee is Emulsie PCR mogelijk en ramps zijn behoorlijk goed. Deze grote machines zijn gewild in de zaadveredeling.
Cycler kiezen?
Ga je met PCR starten, welke machine kies je dan? Vrijwel alle grote producenten leveren prima machines. Denk aan Biorad, Thermo Fisher Scientific, Eppendorf, Isogen, Stilla, Westburg en nog veel meer.
Let vooral op de volgende zaken:
- Ramp tijd
- Gradiëntfunctie
- Type blok (en capaciteit) of rotor?
- Type peltier-elementen; de fabrikant heeft deze informatie
Labdagen en vakbeurzen bieden een goede gelegenheid om apparatuur te bekijken. Voor vergelijkend onderzoek – en als het om de details gaat – biedt de literatuur houvast. Bijvoorbeeld: veel optimalisatie vereist? Dan is een degelijke gradiëntfunctie van groot belang. Zit je in patiëntonderzoek of wetenschappelijk onderzoek? In de research is een tweedehands machine dan prima. Refurbished kan ook. Via Labmakelaar kun je leuke machines scoren; onder de 5000 euro heb je bijvoorbeeld al een gebruikte qPCR machine. Opsteker bij een keuze voor gebruikt: PCR-machines gaan over het algemeen vele jaren mee. Tot slot kun je ook altijd de leverancier om een apparaat op proef vragen.
“Voor elke vraag bekijken we welk platform we nodig hebben. We kijken niet zozeer naar brands, maar naar technologie. Soms is qPCR nodig, soms dPCR, soms next-gen PCR”
dr. Anne Loonen, lector Molecular Technologies for One Health bij Fontys
Voor meer snelheid kan bijvoorbeeld Next Gen-sequencing PCR worden ingezet | foto:Marc van Nierop, Fontys Toegepaste Natuurwetenschappen
Nieuwe generaties PCR-machines
De ontwikkelingen in cyclers staan niet stil, getuige next generation PCR voor snellere en ook nog eens betrouwbaardere cycling. Fontys experimenteert er volop mee. Isogen Life Sciences leverde een NextGenPCR machine van Molecular Biology Systems (MBS, Goes) aan Fontys. Deze machine kan volgens dr. Anne Loonen, lector Molecular Technologies for One Health bij Fontys, een bepaling in 17 minuten uitvoeren die standaard in 92 minuten werd uitgevoerd. En zelfs een PCR onder de 2 minuten is mogelijk: Bij MBS werd een 65 baseparen fragment geamplificeerd in 30 cycli in 1 minuut en 59 seconden!
Hoe doet zo’n machine dat? Loonen vertelt: “Er zijn geen ramp tijden, doordat het systeem zes speciale blokken in drie temperatuurzones heeft. De plaat met samples beweegt tussen deze blokken waardoor je directe hitteoverdracht krijgt. Hoewel alle chemie zal werken, moet je je buffer goed optimaliseren om van de snelheid te profiteren en een passend Taq-polymerase gebruiken.”
Beheersing over het proces is top, zegt ze. “De temperatuurzones zijn energiezuinig en hebben superieure temperatuurcontrole.”
“Er zijn geen 'ramp' tijden, maar wel drie speciale blokken. Je zult je buffer goed moeten optimaliseren en een passend Taq polymerase gebruiken”
Anne Loonen PhD, lector Molecular Technologies for One Health, Fontys
qPCR, dPCR, of Nextgen?
Over de verschillende systemen zegt Loonen: “Voor elke vraag bekijken we welk platform we nodig hebben. We kijken niet zozeer naar merken, maar naar technologie. Soms is qPCR nodig, soms dPCR, soms NextGenPCR.”
MBS heeft recentelijk ook een realtime-machine ontwikkeld. Fontys maakt nog gebruik van een end-point PCR-machine; fluorescentie wordt dan in een FLUOstar Omega uitgelezen. De prijzen van een compleet MBS-systeem gaan vanaf zo’n 15.000 euro.
tk4 Magnetische inductie sneller
Machines met peltierelementen zijn nog steeds de standaard, maar er zijn ook machines in ontwikkeling die nog sneller zijn door het toepassen van magnetische inductie. In een studie uit 2024 bleken de ramps gemiddeld drie keer sneller dan die van peltier-systemen. Belangrijk, want tijdens de ramp tijd vindt mogelijke aspecifieke binding plaats. En dus ook de vorming van een verkeerd product. Magnetische inductie verhit tot 21 graden per seconde, terwijl bij peltier de teller bij 6.5 graden per seconde stokt. Elke wisseling in de PCR-cyclus duurt dan maximaal 2 seconden! En een hele cyclus 50 seconden.
Een complete PCR-amplificatie? Die is nu in 25 minuten klaar, uitgaande van 30 cycli. Supersnel dus. Een nadeel is dat elke nieuwe methode gecertificeerd moet worden – qPCR met een peltier-machine is immers nog de standaard. Ze zijn betrouwbaar en de assays zijn gecertificeerd. Overigens is next generation PCR ook een optie als snelheid telt.
