Moleculaire diagnostiek: laat enzymen voor je werken

Met de kennis van eiwitchemie, DNA-methoden en structuurbiologie zijn we de afgelopen decennia heel ver gekomen in onze kennis over hoe moleculair-biologische enzymen werken. Zo weten we nu dat sommige biologisch actieve moleculen werken als scharnieren, andere als ritssluiting en weer andere zelfs als propellers! De werkingsmechanismen van een paar heel belangrijke enzymen op een rij.

Restrictie-enzymen of endonucleasen

Restrictie-enzymen, ook wel endonucleasen genoemd, zijn enzymen die DNA knippen. Het zijn ‘nucleasen’, want ze werken in op nucleïnezuren en doen dat in de DNA-keten (‘endo’).

Vier enzymtypen

Er zijn vier typen restrictie-enzymen. Meest gebruikt zijn type II-enzymen. Types I-, III- en IV-enzymen worden minder, of vrijwel niet gebruikt.

• Type I is een molecuul dat wel een bepaalde DNA-volgorde herkent, maar daarna volkomen willekeurig knipt. Dat geeft dus geen voorspelbare DNA-fragmenten.
• Type II heeft dat nadeel niet. Vrijwel iedere moleculair-biologische onderzoeker gebruikt daarom type II enzymen. Hun grote voordeel is dat ze een ‘palindroom’ sequentie herkennen en in een vaststaande sequentie knippen. Palindroom staat voor ‘spiegelwoord’ met als sprekende voorbeelden lepel, negen en meetsysteem. In de moleculaire biologie staat een palindroom-sequentie voor DNA-volgorde die tegengesteld dezelfde volgorde van basen geeft. Het bekende enzym EcoRI bijvoorbeeld herkent GAATTC (naar de basen Guanine, Adenine, Thymine en Cytosine). Lees je deze basenvolgorde omgekeerd en ‘complementair’- dus met invulling van de tegengestelde basen, dan staat er ook GAATTC. Er ontstaat zo een symmetrische bindingsplaats. Deze symmetrie zien we terug in het enzym, wat uit twee dezelfde structurele onderdelen bestaat.
• Type III-enzymen herkennen een niet-palindrome sequentie. Twee herkenningssites zijn nodig waarvan de basevolgordes gespiegeld zijn. Het enzym knipt het DNA op zo’n 25-28 basen van de plaats waar het aan het DNA bindt. Dit type enzymen wordt nauwelijks gebruikt.
• Type IV-enzymen zijn nauwelijks specifiek te noemen voor de DNA-basevolgorde. Ze herkennen een stukje dat chemisch veranderd is, meestal gemethyleerd. Ook deze enzymen hebben amper toepassingen.

Type II restrictie-enzymen favoriet

Gezien de toepasbaarheid zoomen we verder in op type II restrictie-enzymen. Hiervan zijn de favorieten hieronder opgesomd. In figuur 1 (titelfoto, boven), waarin een schematische weergave is te zien van het enzym gebonden aan DNA (oranje), is de genoemde symmetrie van dit enzymtype duidelijk herkenbaar.

Type II restrictie-enzymen hebben geen energie nodig om te werken, maar wel magnesiumionen. In de bij de enzymen geleverde buffers zitten alle benodigde stoffen. Na binding vindt het knippen van het DNA plaats en kan analyse of klonering uitgevoerd worden. Er zijn veel leveranciers van deze enzymen, bijvoorbeeld Qiagen, Roche, New England Biolabs en Promega.

Ligase

DNA ligase is typisch inzetbaar voor kloneren. Het valt in de categorie ‘knippen en plakken’. Dit enzym kan losse dubbelstrengs DNA-stukken aan elkaar zetten, mits ze op elkaar passen. Het kan ook enkelstrengs-DNA plakken, maar dat is veel minder efficiënt.

Ligase is ooit gevonden in bacteriofaag T4 en in bepaalde bacteriën. Zo’n bacteriofaag is een virus dat op bacteriën parasiteert. De faag gebruikt ligase om DNA in het bacterie-DNA te brengen en om lineair DNA circulair te maken. Dit is bestand tegen afbraak en het wordt snel vermenigvuldigd.

Het enzym ligase maakt een covalente, zeer sterke binding tussen een vrije hydroxylgroep en een fosfaatgroep, een zogenaamde fosfodiësterbinding. In de biochemie zeggen we dat de 3’ hydroxyl of OH-groep aan de 5’ PO4 of fosfaatgroep gekoppeld wordt. Het heeft daar energie (ATP) voor nodig en er komt een watermolecuul vrij tijdens de reactie. De getallen 3 en 5 geven het koolstofatoom aan waaraan de hydroxyl of fosfaatgroep zich bevindt. Deze getallen worden altijd aangegeven om duidelijk te maken welke richting de DNA-sequentie heeft, dus, simpel gezegd, wat de start en het einde is. Primers, gebruikt bij sequencing en PCR, worden altijd vermeld met het getal 5 om aan te geven in welke richting het DNA aangemaakt wordt. Ligeren vindt plaats bij 12 tot 16 graden en wordt, na een minimale incubatietijd van 10 minuten, beëindigd met een hitte-inactivatie. Langere incubaties leveren betere resultaten, overnacht is standaard.

Taq polymerase

Taq polymerase valt in de categorie ‘kopiëren’ en is het meest gebruikte enzym in de moleculaire diagnostiek. Het maakt van weinig DNA heel veel in een PCR-reactie, zodat er genoeg van is om het eenvoudig te kunnen analyseren, bijvoorbeeld door sequencing.

Hoe werkt dit? Taq polymerase is oorspronkelijk ontdekt in bacteriën die leven in heetwaterbronnen. Het werkt daarom optimaal bij hogere temperaturen. In een typische reactie verlengt Taq polymerase het DNA op een matrijs in aanwezigheid van magnesium, de juiste buffercondities en nucleotiden. Het zet dus nucleotiden aan elkaar. Daarbij bepalen primers het begin- en eindpunt en is de volgorde aangegeven in de matrijs.

In deze amplificatiereactie kunnen we wel zes ordes van grootte vermenigvuldigen; een picogram DNA wordt vermenigvuldigd tot een microgram. En daar kan goed verder mee gewerkt worden.

Reverse transcriptase

Reverse transcriptase (RT) is het enzym dat essentieel is om RNA om te zetten naar DNA. Een veel toegepast enzym, omdat RNA niet, en DNA wel, gebruikt kan worden in PCR of een sequencing-reactie. In drie stappen maakt het enzym op ingenieuze wijze een dubbelstrengs DNA-molecuul van een enkelstrengs RNA-molecuul voor vermenigvuldiging met PCR.

Stap 1:
Een DNA-streng wordt op een RNA-streng gemaakt. Het enzym heeft een RNA-afhankelijke DNA-polymerase activiteit.

Stap 2:
Het afbreken van het oorspronkelijke RNA: de RNAse H-activiteit.

Stap 3:
De DNA-afhankelijke DNA-polymerase activiteit, ofwel het vermeerderen van het DNA.

Heel veel diagnostische kits maken gebruik van RT PCR. Denk aan bijvoorbeeld diagnostiek op RNA-virussen (Corona, bepaalde retrovirussen) of diagnostiek op aanwezige mutaties in de pathologie.

Moderne next generation sequencing methoden maken bij RNA-sequencing ook gebruik van een reverse transcriptie stap. Het bedrijf Oxford Nanopore Technologies heeft een methode om zonder omzetting naar DNA het RNA direct te sequencen. Voordeel is dat je zo naar de oorspronkelijke RNA-moleculen kijkt.

Topoïsomerases

Topoïsomerases veranderen de ‘topologie’, ofwel de ruimtelijke eigenschappen van DNA en fungeren als een soort strijkbout in de moleculaire gereedschapskist. Is het DNA bijvoorbeeld heel erg gedraaid en opgewonden – supercoiled DNA – dan is het DNA in een cel niet te vermenigvuldigen. Eerst moet de topologie van supercoiled naar relaxed.

Topoïsomerases laten het DNA van de ene in de andere vorm overgaan. Dit enzymtype verbreekt de keten, haalt de draaiing eruit en lijmt de keten weer. Eenmaal in een lineaire vorm kan het diagnostische proces beginnen. Het lineair maken van DNA met topoïsomerase is wel een dure bezigheid: het kost bijna 100 keer zoveel als het openknippen (en daarmee lineair maken) van DNA met een restrictie-enzym. Overigens is het gehele proces van ontwinden en repliceren complexer dan dat. Er zijn meer enzymen die een rol spelen, bijvoorbeeld helicase en primase.

Topoïsomerases worden verder ook als doelwit gebruikt voor therapeutica en diagnostiek. Neem kankeronderzoek: soms gaat het delen van cellen te snel. De celdeling kan dan vertraagd worden door de activiteit van topoïsomerases met bepaalde anti-kanker stoffen te remmen. En bij een bepaalde auto-immuunziekte worden antistoffen tegen Topoïsomerase gemeten.

RPA recombinase

RPA recombinase, ook ontdekt in bacteriofaag T4, is een heel bijzonder enzym voor specifieke DNA-amplificaties. De methode, voor het eerst beschreven in 2006, maakt gebruik van gelijkblijvende temperatuur en een recombinase – die isotherm werkt – om DNA te vermenigvuldigen. De methode kan gedaan worden tussen 22° en 45 °C.

Het recombinase vormt met primers en polyethyleenglycol een complex dat de juiste plaats vindt om DNA aan te maken. Hierna komt een polymerase in het spel dat het DNA aanmaakt. Dit alles bij gelijkblijvende temperatuur en dat maakt de aanschaf van een PCR-machine overbodig.

Recombinases zijn sowieso heel interessant om hun eigenschap DNA te kunnen veranderen. Ook bepaalde CRISPR Cas-methodes maken gebruik van recombinases: deze vinden de juiste plaats op het DNA waar vervolgens een door het CRISPR-systeem gemaakte wijziging plaats zal vinden.

Enzymen onmisbaar in de moleculaire biologie

De besproken enzymen zijn veelgebruikte gereedschappen in de moleculaire biologie. Een aantal van hen, zoals de polymerases, ligases, en reverse transcriptases, zijn inmiddels onmisbaar voor de diagnostiek. Het interessante is dat al deze moleculen hun rol hebben in levende cellen en dat we hun eigenschappen gebruikt hebben voor onze eigen toepassingen in biologie en diagnostiek. De ontdekkingen van een groot aantal van deze enzymen heeft terecht de nodige Nobelprijzen in de scheikunde opgeleverd.