Fluorescence activated cell sorting, beter bekend als FACS, is uitgegroeid tot een onmisbare techniek in biomedisch onderzoek. FACS gaat verder dan flow cytometrie, omdat het celpopulaties analyseert én scheidt. Zo kun je razendsnel zuivere celpopulaties verkrijgen en deze gebruiken voor aanvullend onderzoek met PCR of functionele assays.
FACS, oftewel fluorescence activated cell sorting, is dé techniek om van een gemengde suspensie met cellen tot zuivere celpopulaties te komen. Waar flowcytometrie cellen analyseert, gaat FACS een stap verder: het scheidt specifieke celpopulaties razendsnel en met hoge precisie. Hiermee krijg je zuivere celgroepen die direct inzetbaar zijn voor PCR, sequencing of functionele assays.
Flow cytometrie vs FACS
Flow cytometrie is een zeer krachtige tool waarmee duizenden cellen per seconde kunnen worden geanalyseerd. Bij standaard flow cytometrie blijft de informatie beperkt tot data-analyse en ben je de cellen meestal kwijt na de meting. FACS gaat verder. Bij FACS worden geladen druppeltjes met één cel per druppel elektrisch van elkaar gescheiden in losse opvangreservoirs, zodat populaties apart worden opgevangen.
Schematische weergave van de werking van een FACS | foto: Patrick Mulder
FACS werkt als volgt
FACS gebruik je wanneer analyse van cellen niet toereikend is en er losse cellen nodig zijn voor experimenten. Deze techniek haalt hoge precisie en zuiverheid door te sorteren op basis van belangrijke kenmerken van de cel.
FACS selecteert cellen op basis van:
Grootte
Granulariteit, ofwel korreligheid
Expressie van specifieke eiwitten via fluorescente antilichamen
Denk bijvoorbeeld aan immuuncellen, stamcellen of tumorcellen die ieder een uniek eiwit op het celmembraan hebben zitten waarmee deze cellen herkend en gescheiden kunnen worden.
Een normale uitsortering met behulp van FACS gaat in drie stappen:
Stap 1. Voorbereiding van cellen
De operator wast de cellen met een buffer, labelt ze met fluorescente antilichamen. Verschillende cellen krijgen daarmee een ander fluorescent signaal.
Stap 2. Opname in het FACS-systeem
FACS-systeem laat de cellen één voor één door de flowcel gaan en straalt deze aan met één of meerdere lasers. Door de belichting zullen de fluorescente antilichamen licht uitzenden dat de detectoren opvangen.
Stap 3. Analyse en sortering
Het FACS-systeem analyseert de signalen en geeft de passerende cellen wel of geen elektrische lading op basis van de gekozen instellingen. De elektrische lading wordt gebruikt om de cellen vervolgens te sorteren door ze te verwijderen of apart op te vangen.
De signalen die tijdens stap 3 worden gemeten, worden weergegeven in grafieken waarin elke stip één individuele cel representeert. In deze plots worden celgrootte (forward scatter), granulariteit (side scatter) en fluorescentie-intensiteit tegen elkaar uitgezet. Dit maakt de verschillende celpopulaties zichtbaar. Op basis van deze verdeling worden ‘gates’ ingesteld. Dit zijn gebieden op de plot die bepalen welke cellen een elektrische lading krijgen en daadwerkelijk worden gesorteerd. Zo vormt de data-analyse de directe schakel tussen meting en fysieke uitsortering. Zo ziet een standaard FACS plot eruit:
FACS plot met scheiding van monocyten op basis van forward (celgrootte) en side scatter (celgranulariteit) | foto: Patrick Mulder
→ Bekijk hier hoe je FACS toepast
FACS - Fluorescence Activated Cell Sorting: meer weten
