Flowcytometrie: historie, werking, toepassingen en innovaties

De naam flowcytometrie bestaat uit twee delen: ‘flow’ om aan te geven dat het systeem een voortdurende stroming van vloeistof heeft en ‘cytometrie’ wat staat voor het bestuderen van cellen.

Een flowcytometer bestaat uit een:

• Vloeistofsysteem
• Flow cell
• Laser(s)
• Optische lenzen, spiegels en filters
• Detectoren (fotomultipliertubes (PMT’s))
• Computer en software

Hiermee verzamelt de flowcytometer informatie over de cellen in de vloeistof. Zo bepaalt het systeem niet alleen het aantal cellen in het sample, maar ook de eigenschappen van deze cellen. Het analyseren van cellen uit bloed met behulp van flowcytometrie heet immunofenotypering.

FCM versus FACS

Flowcytometrie (FCM) is de basistechniek voor het kwantificeren van cellen en het meten van de daarbij horende eigenschappen. Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is een uitbreiding op deze techniek. FACS gebruikt de verschillen in het elektrische of fluorescentiesignaal om cellen van elkaar te scheiden ofwel de-sorteren.

Flowcytometer: de historische ontwikkeling

In de jaren 50 introduceerde Wallace H. Coulter de voorlopende techniek van flowcytometrie, ook wel bekend als het ‘Coulter Principe’. Met deze techniek ontwikkelde hij een manier om cellen te tellen door deze langs een elektrisch veld te drijven en het verschil in weerstand te meten. Dit systeem commercialiseerde hij als de Coulter Counter.

In 1965 publiceerde Mack Fulwyler in het vakblad Science de techniek die men ziet als het begin van de flowcytometrie, zoals we die nu kennen. Hij werkte het idee van Coulter verder uit en vond een methode uit om cellen te sorteren op basis van het elektrische signaal (FACS). Een paar jaar later (1968) breidde Wolfgang Göhde de techniek uit met toepassing van fluorescentie in het systeem.

In de jaren 70 volgde de ontwikkeling van commerciële apparaten door verschillende bedrijven waaronder:

• 1971 de Cytofluorograph van Bio/Physics Systems Inc.,
• 1973 de PAS 8000 van Partec
  Enkele jaren daarna volgden de eerste FACS-systemen
• 1974 de FACS van Becton Dickinson
• 1975 de ICP 22 van Partec/Phywe
• 1977 de Epics van Coulter

Flowcytometrie: het werkingsprincipe in 6 stappen

De flowcytometer gebruikt een vloeistofstroom om cellen langs een laser te leiden. Het apparaat maakt daarbij gebruik van optische detectie om fysieke en chemische eigenschappen van iedere cel te bepalen. Samples zijn snel te meten, want de cellen gaan razendsnel langs de laser. Doorgaans zijn samples binnen tientallen seconden tot enkele minuten gemeten. De basistechniek voor het analyseren van cellen werkt voor de meeste flowcytometer systemen als volgt:

1. De gebruiker labelt cellen met antilichamen die een fluorescent signaal bevatten (ook wel markers genoemd). Deze antilichamen bevatten een uniek fluorochroom (kleur) en binden aan specifieke antigenen die aanwezig kunnen zijn op de cellen.
2. De gebruiker biedt de suspensie met gelabelde cellen aan en de pipetteerrobot neemt de cellen op in het systeem. Het systeem gebruikt een vloeistofstroom om de opgenomen cellen voort te bewegen.
3. Het systeem vloeit de cel suspensie langs een smalle buis (dit heet doorgaans de ‘flow cell’ of ‘flow chamber’) waar de cellen één voor één langs een laser passeren.
4. Verschillende cellen laten het licht van de laser op een andere manier breken. De detectoren in het systeem meten hierdoor een uniek signaal (verstrooiing van het licht) van de passerende cellen.
5. Naast deze basiseigenschappen meet het systeem ook de aanwezigheid van verschillende fluorescentie signalen. Dit signaal is afhankelijk van de aanwezigheid antilichamen op de cellen.
6. De standaard flowcytometer voert de cellen vervolgens af in een afvoervat. Een FACS-apparaat sorteert de cellen op basis van een elektrische lading die wel of niet aan cellen is afgegeven op basis van de instellingen.

Mogelijke metingen aan cellen en antilichamen

Met een flowcytometer verzamel je deze informatie:

1. De verstrooiing van het licht als cellen de flow cell passeren geeft informatie over: De grootte van de cellen op basis van de forward scatter, de voorwaartse lichtdetectie. De granulariteit ofwel korreligheid/complexiteit van de cellen op basis van de side scatter, de zijwaartse lichtdetectie
2. Aanwezigheid van antilichamen op basis van de aanwezigheid van een fluorescent signaal. Tevens meet de flowcytometer de intensiteit van dit signaal, wat in de meeste gevallen gelijk staat aan de hoeveelheid antilichamen die zijn gebonden aan de cel.
3. Het aantal cellen dat voorbij de laser komt. Het systeem telt de cellen en redeneert hoeveel cellen er in het sample aanwezig zijn.

Interpretatie van de flowcytometrische data

De flowcytometer zet de gegevens van de detectoren om in databestanden. Met behulp van speciale software kunnen deze databestanden worden ingelezen en geanalyseerd. Tegenwoordig bestaan er voor dit doel talloze programma’s; bekende voorbeelden hiervan zijn FlowJo, FCS Express, Kaluza, FlowLogic en Cytobank.

De software zet de data om in grafieken, waaronder histogrammen en dot-plots. Deze grafische weergaven helpen wetenschappers om verschillende cel populaties te identificeren en te karakteriseren op basis van de gemeten parameters. Zo kan de gebruiker bijvoorbeeld onderscheid maken tussen granulocyten, monocyten en lymfocyten, die een specifieke ligging hebben op de dotplot van de forward scatter (grootte) en side scatter (granulariteit).

Toepassingen van flowcytometrie

Flowcytometrie kent vele toepassingen, zowel in de diagnostiek als het onderzoek:

Flowcytometrie in klinische diagnostiek

In de klinische setting is flowcytometrie een onmisbaar hulpmiddel voor het vaststellen van bepaalde aandoeningen waaronder:

1. Infectieziekten
2. Auto-immuunziekten
3. Immuundeficiënties
4. Verschillende vormen van kanke

Flowcytometrie is belangrijk in de hematologie en oncologie en maakt het mogelijk om leukemie of lymfomen te classificeren in bloed of beenmergpuncties. Middels immunofenotypering stellen artsen en laboranten de aanwezigheid van abnormale celpopulaties vast. De techniek kan ook informatie geven over afweerreacties bij orgaantransplantatie of beenmergtransplantatie. Zo kunnen artsen op tijd de juiste behandeling inzetten.

Flowcytometrie in research

In onderzoek kent flowcytometrie ook veelvuldige toepassingen. Zo is de techniek niet weg te denken uit research; belangrijke voorbeelden hiervan zijn:

1. Immunologie
2. Hematologie
3. Cardiologie
4. Oncologie
5. Auto-immuunziekten
6. Pathologie
7. Neurologie
8. Ontwikkeling geneesmiddelen

Onderzoekers gebruiken de techniek om cel interacties die belangrijk zijn voor de ontwikkeling van ziektes bloot te leggen. Door een beter begrip van onderliggende mechanismen van ziektes komen onderzoekers ook dichter bij geneesmiddelen.

Flowcytometrie: 10 tips

1. Bereid de flowcytometer voor. Volg de gebruikershandleiding en richtlijnen van de fabrikant. De meeste flowcytometers draaien op een eigen softwareprogramma en de handelingen en buffers zijn vaak uniek. Zorg dat het systeem goed onderhouden blijft. Laat ook de lasers afstellen en zorg dat de software up-to-date blijft. Zorg dat de lasers op de juiste temperatuur zijn voordat je gaat meten. Volg de handleiding van het systeem om te kalibreren voor gebruik.
2. Zorg voor een optimaal signaal van de antilichamen. Gebruik de juiste fluorochromen en check of deze geschikt zijn voor de set-up van het systeem.
3. Zorg dat de compensatie instellingen op orde zijn: de compensatie is meestal zowel in het systeem als in de software in te stellen. Zorg dat beide goed zijn afgesteld door eerst single stains van de samples te runnen. Gebruik ook niet meer antilichamen dan nodig. Het gebruik van meer kanalen geeft over het algemeen meer problemen bij de compensatie en analyse. Fluorescence minus one (FMO) samples kunnen helpen met de compensatie instellingen.
4. Stel de voltages van de detectoren goed in zodat de verschillende cel populaties te identificeren zijn.
5. Gebruik een buffer om de kwaliteit van de cellen te behouden. Een buffer met natrium-azide voorkomt bijvoorbeeld dat cellen antilichamen internaliseren, ofwel opnemen. Door gebruik van een fixatief zoals formaldehyde zijn cellen langer te bewaren.
6. Voorkom verstopping van het systeem door de flow cell te wassen en schone samples aan te bieden. Zorg dat er geen klontjes in het sample aanwezig zijn om verstopping van het systeem te voorkomen. Gebruik je cellen afkomstig uit weefsel of bloed, zorg er dan voor dat weefselresten en rode bloedcellen verwijderd zijn, bijvoorbeeld door gebruik te maken van cell strainers en een lysis buffer. Een schone flow cell geeft minder vervuiling in de meeting en dus betere resultaten. De meeste systemen hebben een protocol voor het wassen van de flow cell.
7. Gebruik de juiste controles: neem een niet-gelabeld sample mee in de analyse om de aanwezigheid van autofluorescentie te controleren en gebruik deze voor de analyse van de data. Gebruik een isotype controle en/of receptor blokkade om uit te zoeken of aspecifieke binding van antilichamen optreedt.
8. Gebruik een live-dead stain om onderscheid te maken tussen levende, apoptotische of dode cellen, bijvoorbeeld met behulp van 7-AAD, propidium iodide, ZombiAqua of Annexin V.
9. Werk de data op de juiste manier uit. Blijf consistent bij het zetten van de gates om celpopulaties te identificeren. Zorg altijd dat meerdere analisten de data uitwerken en/of controleren. Als meerdere personen de data onder ogen hebben gehad, is de kans op fouten kleiner.
10. Verwerk voldoende samples om statistiek toe te kunnen passen. Een sample size berekening kan hierbij helpen. Zorg bij het verzamelen van samples om verschillende tijdstippen dat de samples zo veel mogelijk op dezelfde manier behandeld zijn (denk aan de timing, duur en incubatietijden).

Laatste ontwikkelingen op het gebied van flowcytometrie

De ontwikkeling van flowcytometrie staat niet stil. Aanbieders van de flowcytometer werken continu aan de uitbreiding van de techniek en verbetering van de systemen. Denk bijvoorbeeld aan snellere vloeistofsystemen, een betere flow cell of vernieuwde hard- en software.

Een aantal recente ontwikkelingen op een rij:

• Verbeterde fluorochromen: stabielere fluorochromen met een sterker signaal.
• Automatisering en standaardisering: verbeteringen om variatie tussen gebruikers te verkleinen en de systemen toegankelijker en gebruiksvriendelijker te maken.
• Spectraal flowcytometrie: meet het gehele emissie spectrum
• Mass cytometry (CyTOF): combineert flowcytometrie met massaspectrometrie, waardoor tientallen tot honderden markers tegelijk te meten zijn.
• Imaging flowcytometrie: system maakt microscopische foto’s van de cellen die voorbijkomen om de analyse visueel te maken.
• Microfluidic flowcytometrie: vergroot de precisie van de metingen.
• Combinatie met single-cell sequencing en omics technologie: krijg een nog gedetailleerder beeld van gesorteerde samples door gebruik van sequencing, genomics of proteomics.
• High-dimensionale analyse: ga een stap verder in de data-analyse en ontdek nieuwe patronen en celpopulaties.
• Real-time data-analyse: waardoor onderzoekers direct beslissingen kunnen nemen tijdens het experiment.
• Gebruik van artificial intelligence en machine learning: om patronen in data op te sporen en data-analyse (gedeeltelijk) te automatiseren.

Toekomst van flowcytometrie

Flowcytometrie is een veelzijdige techniek en onmisbaar zowel in diagnostiek als in onderzoek. De toekomst van flowcytometrie is veelbelovend dankzij geavanceerde fluorochromen, mass cytometrie (CyTOF), en integratie met AI en machine learning voor verbeterde experimenten en data-analyse. Net als de metingen in het systeem, gaan ook de ontwikkelingen razendsnel. Er staat ons nog veel te wachten van deze techniek.