Tiffany De Troyer (links) en Kimberly De Windt (rechts), beiden promovendi bij Laboratory of Integrative Metabolomics van de Universiteit Gent | Foto: Universiteit Gent
Een nieuwe pipetteerrobot automatiseert een groot deel van de complexe monstervoorbereiding voor analyses met vloeistofchromatografie (HPLC) gekoppeld aan MS. Dit verhoogt de efficiëntie en draagt bij aan een gestandaardiseerde en reproduceerbare werkwijze. Promovendus Kimberly De Windt van het Laboratory of Integrative Metabolomics van de Universiteit Gent licht toe hoe de pipetteerrobot binnen haar onderzoek wordt ingezet.
Een gestandaardiseerde monstervoorbereiding voor analyses met vloeistofchromatografie/MS is essentieel voor betrouwbare resultaten. Dat kan met een op maat aanpasbare pipetteerrobot, zo blijkt op het Laboratory of Integrative Metabolomics (LIMET) in Gent. Het team onder leiding van prof. Lynn Vanhaecke zet hiervoor een geautomatiseerd pipetteerstation in. De Windt deelt haar ervaringen over de pipetteerrobot, die ruim 40 dagen achtereenvolgend is ingezet voor de extractie van grote aantallen fecale monsters voor metabolomics- en lipidomicsanalyses met het oog op de overgewichtsproblematiek bij jeugdigen.
Detailfoto's van de ePrep ONE tijdens de bifasische fecale extractie voor metabolomics- en lipidomicsanalyses | foto: Universiteit Gent
tk1 Strategieën tegen kinderobesitas
De Windt onderzoekt de biologie van kinderobesitas met als doel gepersonaliseerde strategieën voor de preventie en behandeling van deze aandoening te ontwikkelen. Daarbij bestudeert ze hoe veranderingen in het metaboloom, de complete verzameling van stofwisselingsmoleculen, samenhangen met het ontstaan en de ontwikkeling van kinderobesitas. Ook kijkt ze naar lipiden; vetachtige moleculen die het lipidoom vormen. Haar onderzoek richt zich op fecale metabolieten, de kleinste afbraakproducten van moleculen, die waardevolle inzichten geven in zowel de mentale als lichamelijke gezondheid, het voedingspatroon, als de activiteit van het darmmicrobioom.
Targeted en untargeted analyses
Binnen het onderzoek kijkt De Windt zowel gericht (targeted) als ongericht (untargeted) naar metabolieten. Met gerichte analyses brengen de onderzoekers de aantallen en het type moleculen met behulp van referentiestandaarden in kaart. “Een relatief klein deel van alle aanwezige metabolieten kunnen we op deze manier betrouwbaar detecteren. Het gaat bijvoorbeeld om aminozuren, galzouten en vetzuren”, vertelt De Windt. “Dankzij een ongerichte analyse kunnen we veel breder zoeken en ook moleculen opsporen waarvan er nog geen of alleen zeer dure standaarden beschikbaar zijn. Die moleculen kunnen ons helpen de complexe biologische processen die betrokken zijn bij kinderobesitas beter te begrijpen.”
“Doordat de handmatige monstervoorbereiding wordt overgenomen komt er circa vijf uur per dag vrij voor andere taken”
Kimberly De Windt, Universiteit Gent
tk2 Geautomatiseerde extractie en analyse
Voor de gecombineerde metabolomics- en lipidomicsanalyse wordt een tweefasige extractie gebruikt. De combinatie van polaire en apolaire oplosmiddelen verdeelt de metabolieten en lipiden op basis van hun fysisch-chemische eigenschappen over de verschillende fasen. De robot voert de extractie en filtratie grotendeels geautomatiseerd uit. De analyse van de extracten gebeurt met ultra-high-performance liquid chromatography (UHPLC), gekoppeld aan een Orbitrap-massaspectrometer (MS). Daarnaast wordt gebruikgemaakt van een dual LC-MS-systeem. Terwijl één LC-kolom wordt geherconditioneerd, kan de analyse met de andere kolom al gestart worden. “Door beide kolommen afwisselend in te zetten, behalen we een tijdswinst van ongeveer 21% ten opzichte van het afzonderlijk uitvoeren van beide methoden.”
tk3 Optimalisatie monstervoorbereiding
De extractieprocedure was nog niet eerder met deze pipetteerrobot uitgevoerd. “We waren direct enthousiast over de mogelijkheden, maar vanwege de complexiteit van ons protocol heeft de optimalisatie ongeveer twee maanden geduurd.”
Het pipetteerstation ePrep ONE, geleverd door Instrument Solutions, werd op maat ingericht en geoptimaliseerd met behulp van een experimenteel screeningdesign. “Nadat we de pipetteersnelheden en pipetteerdieptes hadden geoptimaliseerd, varieerden we vijf parameters tegelijk, goed voor een design van 17 runs. Van het toevoegen van de oplosmiddelen tot de extractie en filtratie werd het proces geautomatiseerd. Alleen het centrifugeren en het indampen onder stikstof gebeuren nog handmatig.”
De optimalisatie maakte het bovendien mogelijk om enkele handmatige stappen te schrappen. “Vortexen en roteren bleken niet meer nodig, omdat de robot de stalen voldoende krachtig kan mengen.”
“Van het toevoegen van de oplosmiddelen tot de extractie en filtratie werd het proces geautomatiseerd”
Kimberly De Windt, Universiteit Gent
tk4 Voordeel van naalden
Het pipetteersysteem werkt met naalden in plaats van conventionele wegwerppipetpunten. De naalden prikken door het septum van gesloten vials, waardoor de extracten tijdens het pipetteren in een gesloten systeem blijven.
“Voor onze toepassing is dat een belangrijk voordeel”, aldus De Windt. “We werken met organische oplosmiddelen. Deze komen tijdens het pipetteren niet in contact met plastic pipetpunten en doordat de vials gesloten blijven, wordt ook verdamping van de organische fase beperkt. Dat helpt om veranderingen in de oplosmiddelsamenstelling tussen stalen te voorkomen.”
Blokkade door tubing
Het systeem werd gedurende 43 dagen ingezet voor de voorbereiding van 1426 monsters. “Op werkdagen draaide de extractie ongeveer acht uur per dag.” Tijdens deze periode ontstond een probleem met de afvalafvoer van de solventen. Door langdurig contact met sterke organische oplosmiddelen verhardde een deel van de afvoerleiding, waardoor de solventen onvoldoende konden worden afgevoerd en het afvalreservoir overliep. Deze ‘bug’ was snel verholpen. “De peristaltische pompen konden de gebruikte solventen niet meer met voldoende debiet afvoeren. Nadat we de betreffende slang hadden vervangen, was het probleem snel opgelost.”
tk5 Bijna 5 uur tijdswinst
Al met al heeft het lab met de komst van dit pipetteerstation een efficiencyslag gemaakt. Toch zit de grootste tijdswinst volgens De Windt niet in het sneller uitvoeren van de afzonderlijke pipetteerstappen. Het wisselen van naalden en de noodzakelijke spoelingen nemen immers tijd in beslag. “De geautomatiseerde uitvoering draagt bij aan een meer gestandaardiseerde en reproduceerbare monstervoorbereiding. De belangrijkste winst is dat de handmatige monstervoorbereiding bijna volledig wordt overgenomen. Daardoor komt ongeveer vijf uur per dag vrij voor andere taken, zoals data-analyse en het voorbereiden van andere experimenten.”
Pipetteerstation ePrep ONE
- De ePrep ONE kan series van 5 tot 200 stalen verwerken en biedt plaats aan maximaal 16 verschillende naalden, zoals te zien was op LabAutomation 2026.
- Met een plug & play-systeem kunnen trays en platen naar wens apart ingericht worden.
- Het is een erg flexibel pipetteerstation met toegankelijke software, waarbij alles handmatig is in te stellen.
- De software controleert ook automatisch of het station juist is ingericht en oplossingen aanwezig zijn via RFID-tags.
