CyTOF MassaCytometer van DVS Sciences
Flowcytometrie met vluchttijd-massaspectrometrie levert zo veel data op over het immuunsysteem, dat de verwerking een knelpunt wordt. Cytosplore-software, ontwikkeld door immunologen van het LUMC en computerwetenschappers van de TU Delft, moet uitkomst bieden bij de datamining.
Flowcytometrie met time-of-flight massaspectrometrie, cytometry by time of flight, is de overtreffende trap in onderzoek van het immuunsysteem. CyTof biedt een veel hoger detailniveau dan flowcytometrie met Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS). Toen CyToF-technologie op een congres werd gelanceerd, raakte professor Frits Koning van de afdeling Immunohematologie en Bloedtransfusie van het LUMC onmiddellijk enthousiast.
Het LUMC dat het ‘moest doen’ met FACS flowcytometrie, wilde zo snel mogelijk van de revolutionaire mogelijkheden gebruik kunnen maken. De technologie kwam er. Promovendus Vincent van Unen mocht vanaf 2013 de potentie ervan in de praktijk bewijzen.
FACS Flowcytometrie
Immunologen bij het LUMC maakten toen al tien jaar gebruik van FACS flowcytometrie om te meten aan stromende cellen. Cellen krijgen bij deze technologie een etiket opgeplakt door er antilichamen aan te koppelen met fluorescente labels. Vervolgens passeren de gelabelde cellen een voor een in grote hoeveelheden een buis en worden blootgesteld aan (laser)licht.
Uit het spectrum van lichtbreking en door de cellen uitgezonden licht kan de onderzoeker afleiden om welk type cel het gaat. Het fluorescentiespectrum maakt detectie tot maximaal twaalf markers mogelijk. Dit levert 212 ofwel 30.000 potentiële combinaties van eiwitprofielen op. Dit lijkt heel wat, maar toont slechts een glimp van de complexiteit van het immuunsysteem.
CyToF
CyToF doet in essentie hetzelfde als FACS flowcytometrie. Het verschil is dat het antilichamen niet koppelt aan fluorescente markers, maar aan zware metalen. Om de meting te doen, verbrandt de CyToF de cel. Daarvan blijft alleen een wolkje ionen van de zware metalen over dat op reis gaat in de vluchttijdbuis van de massaspectrometer. Een time-of-flight (ToF)-detector meet de verschillen in aankomsttijd en identificeert om welke zware metalen het gaat. Daarmee is bekend welke antilichamen en dus ook eiwitten er op het celoppervlak zaten – en dus om welke immuuncel het gaat. Omdat er veel verschillende zware metalen gebruikt kunnen worden, maakt deze technologie een veel grotere markerset mogelijk dan FACS flowcytometrie.
Van Unen, inmiddels postdoc aan Stanford University: “In potentie brengt CyToF alle verschillende immuuncellen in een monster in kaart, met alle vijf de hoofdtakken van zowel het aangeboren als het adaptieve immuunsysteem, inclusief alle subgroepen. Je kunt zowel de breedte – verschillende celpopulaties – als de diepte – de volwassenheid van een cel – in kaart brengen.”
“De ‘glimp’ verandert daarmee in een hogeresolutiebeeld van een deel van het totaalplaatje.” Er is wel een knelpunt. De 30.000 combinaties bij FACS flowcytometrie nemen bij CyToF namelijk exponentieel toe tot een triljoen combinaties. “Dat is 1.000.000.000.000.000.000.”
Algoritme
De bestaande software voor flowcytometrie trekt dit soort aantallen niet. De stap van 12 naar 32 of zelfs 36 markers heeft grote gevolgen voor de rekenduur. Elf dagen stond de supercomputer te ratelen bij de computerwetenschappers van de TU Delft waar de immunologen van het LUMC mee samenwerken [5 jaar geleden, red.], maar de opgave blijkt te groot: CyTOF-apparatuur voor massacytometrie levert zoveel data op dat bestaande algoritmen het niet kunnen behappen.
De bestaande software was niet schaalbaar; de algoritmen erin kunnen de data niet aan, stelt Van Unen. “Je hebt een Formule 1-auto, maar kunt er nog niet in rijden.” Van Unen ontdekte dat Columbia University een algoritme inzette om CyToF-gegevens sneller te analyseren. De berekeningsmethode zet niet-lineaire gelijkenissen in een rangorde, zodat er verbanden zichtbaar worden. “Ze gebruiken het distributed Stochastic Neighbor Embedding (t-SNE) machine learning algoritme. Dat maakt een 2D-visualisatie mogelijk. Het algoritme bleek ontwikkeld te zijn door Laurens van der Maaten aan de TU Delft!”
Cytosplore
Bij de Computer Graphics & Visualisation Group van de TU Delft werkt Nicola Pezzotti nu verder aan de t-SNE-engine. Hij moet sneller en schaalbaar worden. Dit zou interactieve, visuele analyse binnen bereik brengen. De CyToF-applicatie is hiervoor een mooie testcase. Pezotti’s collega Thomas Höllt ontwikkelde extra visualisatie- en interactiecomponenten rond tSNE voor deze concrete toepassing. Dankzij deze combinatie maakt de open source software onder de naam Cytosplore honderd keer sneller werken mogelijk.
Immunity
Van Unen had met de nieuwe software een oplossing voor het dataprobleem gevonden. Een jaar nadat zijn promotieonderzoek begonnen was, kon hij eindelijk beginnen met data-analyse. Dat stelde hem in staat om enkele jaren later patronen te ontdekken in de complexe materie.
Van Unen: “Tijdens een eerste studie konden we met 32 markers 142 subsets ontrafelen. Het artikel hierover in Immunity bereikte met retweets in één maand 127.000 mensen. Bij de tweede studie naar darmontstekingsziekten werkten we met een verbeterde set van 36 antilichamen, wat tot 300 gevonden subsets leidde.”
“We zagen hoe de samenstelling van de subsets verschilde tussen de uiteenlopende darmziekten. We konden ziekten onderscheiden op basis van hun immuuncelinfiltratie. We kregen een totaalbeeld van de immuunreacties, inclusief de wisselwerking tussen aangeboren en adaptieve componenten.” Dit gedetailleerde beeld leverde waardevolle informatie op over coeliakie, de ziekte van Crohn en enteropathie-geassocieerd T-cellymfoom (EATL).
Rijpe cellen
Bovendien leverde de data een uniek inzicht in het rijpingsproces van het immuunsysteem. Van Unen: “We hebben CyToF vervolgens ingezet voor onderzoek van de darm in ongeboren baby’s. De sleutel tot begrip van chronische darmaandoeningen ligt in de ontwikkeling van het immuunsysteem. Tot nu toe geldt als dogma dat de foetale darm een steriele omgeving is. Recente onderzoeksresultaten laten ruimte voor een andere interpretatie. Aangeboren immuuncellen en T-cellen in de foetale darm blijken te zijn uitgerijpt. Voor T-cellen betekent dit dat ze al specifieke antigenen zijn ‘tegengekomen’.”
Het rijpingsproces blijft nog onduidelijk. “Duidelijk is wel dat een ongeboren kind is voorbereid op de bacterierijke omgeving tijdens de geboorte.”
Samenwerking
De Cytosplore software werd meer dan 2000 keer gedownload – enorm veel, gezien het feit dat er nu maximaal tweehonderd CyToF in de wereld staan. Het LUMC heeft er inmiddels twee. UMC Utrecht en UMC Amsterdam beschikken er elk over een. Van Unen onderstreept hoe belangrijk bio-informatica in het immunologisch en -omics onderzoek is geworden voor fundamenteel begrip van het immuunsysteem.
“Het ontrafelen van complexe ziekten vereist complexe technologieën. Om goed uit de voeten te kunnen in dat speelveld is het van groot belang dat immunologen en microbiologen samenwerken met bio-informatici.”
Redactie: Leendert van der Ent | fotografie: LUMC
