Met een workflow voor het zoeken naar zogenaamde ‘unknown unknowns’ kunnen laboratoria componenten identificeren die onbekend zijn bij de analist/onderzoeker én ontbreken in massaspectrometrie databases. Doorontwikkelde Orbitrap-MS is de techniek voor het vinden van die ‘naalden in de hooiberg’ en biedt een verbluffend gebruiksgemak.

Redactie: Vincent Hentzepeter

Het ‘routinematig’ identificeren van onbekende verbindingen via GC/MS is een trend die de laatste jaren is ingezet in onder meer de milieu- en voedingsanalyse. Het gaat om bijvoorbeeld nieuwe chemische en farmaceutische stoffen, metabolieten van biologische processen. Meer recent neemt de vraag toe binnen het domein van de exposomics. Dit is een opkomend vakgebied voor onderzoek naar het identificeren van alle stoffen waaraan de mens dagelijks wordt blootgesteld. Buiten voedingsmiddelen betreft het ook de ingeademende lucht. Door te identificeren om welke stoffen het bij deze blootstelling gaat en dit te relateren aan ziektebeelden, denken onderzoekers meer inzicht te krijgen in welke factoren de gezondheid positief en negatief beïnvloeden. Centraal in dit verhaal staat hoge resolutie, accurate massa (HR/AM) massaspectrometrie. Het is deze technologie die het mogelijk maakt om onbekende verbindingen snel en met grote zekerheid te bepalen. Slimme software neemt de complexe data-interpretatie uit handen.

Massa-accuratesse

Prof. dr. Joeri Vercammen, gastprofessor aan de Universiteit Gent bij de Vakgroep Materialen, Textiel en Chemische Proceskunde en hoofd van IS-X - het expertisecentrum van Interscience, noemt het gebruik HR/AM massaspectrometrie een trend die qua GC-toepassing ruim 5 jaar geleden werd ingezet. ‘Eigenlijk sinds de introductie van de GC-Orbitrap door Thermo Fisher Scientific in 2015. Deze technologie heeft het voor laboratoria mogelijk gemaakt om naast een target analyse op – zeg een standaardset van 200 pesticiden of 100 milieucontaminanten – ook onbekende componenten op relatief eenvoudige manier correct te identificeren. Verbindingen waar je het bestaan niet van kent, omdat er geen spectrale info beschikbaar is. De massa-accuratesse van de techniek, uitgedrukt in cijfers na de komma nauwkeurig, is zo hoog dat de chemische brutoformule van de molecule zonder meer correct is af te leiden. Je zogenaamde mono-isotopische afwijking moet daarvoor kleiner zijn dan 0,5 ppm – deeltjes per miljoen – wil je bijvoorbeeld ‘exact’ kunnen besluiten dat je een decaanachtige als ‘C10 H20 O2’ te pakken hebt.”

Orbitrap is misschien trager dan een Tof, maar je kunt wel supernauwkeurig meten
Joeri Vercammen

Softwarealgoritme

Een voorbeeld uit de praktijk: “Stel de massa is 172,14633 amu; bij 0,5 ppm error meet het toestel 172,14642 amu. Dat verschil bedraagt met andere woorden 0,00009 amu. Weet dat massa van een elektron 0,00055 amu bedraagt! Hoe exact wil je het hebben. De combinatie van hoge massa-accuraatheid en massaresolutie maakt het aantal kandidaatverbindingen op basis van brutoformule én isotoopverdeling dusdanig klein, dat je het aantal potentiële componenten kan terugbrengen van zeg 50 naar slechts 2 of 3. Zo kun je heel vlot onbekende componenten correct identificeren.” De resultaten liggen snel op tafel dankzij een geavanceerd softwarealgoritme dat met de apparatuur wordt meegeleverd. “De spectrale gegevens uit standaardbibliotheken worden gebruikt om te bepalen in hoeverre de chemische samenstelling van jouw spectrum overeenstemt met dat uit de NIST of een analoge bibliotheek.”

Pilot in Parijs

Hoe goed dit toestel scoort bij de bepaling van onbekende componenten bleek bij een eerste project dat IS-X in Parijs mocht uitvoeren voor een groot farmaconcern. “Ze hadden een aantal onbekende moleculen opgestuurd. Binnen drie dagen konden we de chemische structuur van de componenten voorspellen. En die resultaten waren correct. Ze konden niet geloven dat wij op basis van nauwkeurige massameting de chemische structuur konden achterhalen. Dat maakt GC-Orbitrap echt wel uniek. Er is geen ander high res toestel op de markt dat dit kan. De nieuwste versie biedt een resolutie van 240.000 FWHM. Dat wil zeggen dat massapieken zo smal en nauwkeurig gemeten worden dat je spectrum niet uit alleen één piek bestaat, maar ook alle mogelijk isotooppieken. Samen vormen ze een soort QR-code die uniek is voor de chemische samenstelling. Dus hoeveel koolstof, stikstof, zwavel, noem maar op zit er in de chemische samenstelling van één fragment-ion. Dat is onvergelijkbaar met bijvoorbeeld een quadrupool-MS, de meest gebruikte massaspectrometer op het lab. Daarbij wordt alles binnen delta plus of min een half beschouwd als bijvoorbeeld massa 32. Bij GC-Orbitrap verkrijg je supersmalle pieken voor één specifieke massa, die combinatie van hoge resolutie en accurate massa vormt de kracht van deze technologie.”

Ze konden niet geloven dat wij op basis van nauwkeurige massameting de chemische structuur konden achterhalen
Joeri Vercammen

Supernauwkeurig meten

Mengsels van fragmentionen worden in de Orbitrap geïntroduceerd met standaard technieken, zoals gas- of vloeistofchromatografie. “Die elueren in de ionisatiebron waar ze in het geval van GC worden beschoten met elektronen, bij LC worden andere ionisatietechnieken gebruikt als ESI en APCI. Na focussering worden de fragmentionen geïntroduceerd in de Orbitrap en gaan ze oscilleren, hoe langer deze oscillatie, hoe beter fragmenten met gelijkaardige massa van elkaar gescheiden worden. Na 1 x zie je niets, na duizenden keren kun je fragmentionen die weinig van elkaar verschillen toch onderscheiden. Dat is anders dan bijvoorbeeld bij een vluchttijd-massaspectrometer. Bij een MS-Tof worden de fragmenten afzonderlijk gedetecteerd, hierbij worden ze van elkaar gescheiden en gedetecteerd in een continu proces. Orbitrap is misschien trager dan een Tof maar je kunt wel supernauwkeurig meten.” Dit laatste hangt zoals bij elk toestel af van de instellingen. “Zet je hem minder nauwkeurig op 60.000 FWHM in plaats van 240.000 FWHM, dan kun je ook snelle metingen uitvoeren.”

Gebruiksvriendelijk en robuust

Zo complex als de techniek is, zo simpel is die in gebruik. “Je krijgt het eenvoudig operationeel, hoeft niet te tunen. Hij is klaar voor gebruik, gebruiksvriendelijk en robuust. Als er al problemen optreden met het systeem heeft dat eerder te maken met bijvoorbeeld een vervuilde liner in de GC.” Een factor om rekening mee te houden is dat dit soort systemen met een ultradiep vacuüm werkt. “Dat moet heel stabiel worden gehouden. Om te vermijden dat je bij het plaatsen van een kolom met een andere selectiviteit het vacuüm moet verbreken, werd een systeem ontwikkeld dat het vacuüm in stand houdt bij kolomvervangingen.”

Flexibele combinaties

Daarnaast heeft IS-X een opstelling gevalideerd om twee kolommen onafhankelijk van elkaar te koppelen aan eenzelfde Orbitrap in een aparte GC-oven. Voordeel is dat het toestel multifunctioneel wordt. “We hebben een opstelling voor een klant gemaakt met twee GC-ovens aan een enkele Orbitrap, zo’n hub heeft zowel voor industrie als in de academische wereld als voordeel dat je flexibeler wordt in het gebruik. Op de universiteit kunnen zo diverse vakgroepen gebruik maken van de kracht van Orbitrap. Beide GC’s kunnen onafhankelijk van elkaar analyses uitvoeren op hun eigen instellingen en kolomkeuze.” Andere combi’s zijn ook denkbaar. “Denk aan liquid injectie op de eneGC en pyrolyse op de andere.”

Een soort QR-code die uniek is voor de chemische samenstelling
Joeri Vercammen

Geautomatiseerde analysestraat

Routineapplicaties met Orbitrap zullen opgang maken, verwacht Vercammen. “Ik zie een tendens naar een geautomatiseerde analysestraat voor monstervoorbereiding in combinatie met GC Orbitrap voor metingen van pesticiden in food, pyrolyse met Orbitrap voor onderzoek naar lignine, thermische desorptie met GC-Orbitrap voor het zoeken naar biomerkers in uitgeademde lucht of voor exposomics. Aan welke stoffen worden we nu tijdens het werk blootgesteld, welke metabolieten ademen we in of uit, krijgen we binnen via onze voeding en welke allergenen zitten er in hygiëneproducten of welke aromastoffen in? Er is zoveel dat we niet weten en dat nu nauwelijks in kaart te brengen is.” Zeker niet met target analyses die deze componenten sowieso missen. “Wat zijn nu die stoffen en hoe frequent komen ze voor? Daar kom je alleen achter met dit systeem dat hoge resolutie accurate massa kan bepalen. Er is zo veel meer te meten dan de honderden stoffen die we nu standaard bepalen.”

workflowmassaspectrometrieOrbitrap-MS